[发明专利]一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法

摘要

本发明提供一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法，包括步骤：1）取田间太子参茎段作为组培用外植体，经消毒、培养，获得组培苗，2继代培养获得大量组培苗，微茎尖培养获得微茎尖脱毒苗3）预培养、装载，4）玻璃化，5）液氮处理，6）解冻，7）诱导成苗，8）病毒检测。本发明专利采用微茎尖结合超低温冷冻疗法脱除太子参蚕豆萎蔫病毒BBMV获得的脱毒苗脱除彻底，剥取茎尖易于操作，在促进太子参产业健康持续发展方面具有广泛的应用价值。

主权项

1.一种利用微茎尖与超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒的方法，其特征在于：所述方法包括如下：1）选取表现蚕豆萎蔫病毒症状的太子参植株；2）取病株植株切取茎段，经灭菌消毒后接种到含0.2mg/L NAA的MS培养基中，待长到4个节时，取茎段接种到MS培养基中，侧芽长1‑1.5cm时在体式显微镜下剥取1‑2mm的芽尖接种到MS培养基中，进行微茎尖培养，培养至成苗；2）切取微茎尖培养的茎段，接到初代培养基上，侧芽长1‑1.5cm时在体式显微镜下剥取1‑2个叶原基的芽尖接种到MS培养基中，培养至成苗；室温培养10d；3）取步骤2）太子参茎段放在继代培养基上室温培养1‑6周；4）剥取步骤3）获得的茎尖1‑2mm，叶原基留1‑3片，茎尖放在培养基上暗培养1‑3天，培养基为MS培养基加0.3mol/L蔗糖、7g/L琼脂，培养温度为4℃；5）取步骤4）预培养过的茎尖放入加载液中，加载液为MS培养基加2mol/L甘油、1mol/L蔗糖，pH=5.8，室温下加载20‑40min；6）取加载过的茎尖转移到PVS2溶液中，在冰上操作，处理30‑50min；7）用移液枪吸取PVS2溶液在铝箔盒打液滴，将步骤6）茎尖放入液滴中，将带液滴的铝箔盒放入液氮中处理30min，立即进行40℃水浴化冻处理0.2‑1.5min，再送入0℃冰水混合物中处理10min；再快速投入卸载液中20min，卸载液为MS培养基加入1.2mol/L蔗糖；8）将茎尖取出放到后培养基中，0℃下暗培养5‑7天，光照强度200lux的弱光培养1个月，获得太子参再生植株；9)利用RT‑PCR技术进行太子参再生植株的BBMV检测，获得脱除太子参蚕豆萎蔫病毒BBMV的株系；10）太子参再生植株在日光下炼苗1个月，壮苗获得健壮植株。