[发明专利]基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒

摘要

本发明提出一个全新的HBV‑cccDNA检测的策略，通过设计与HBV‑DNA序列中DR2区域下游配对的启动引物对HBV‑cccDNA正链进行基于通用碱基的插入替换的单链DNA扩增，得到含有通用碱基的新生的单链DNA，并依此设计与HBV‑DNA的DR2区域上游配对的选择引物，可以特异性结合该含有通用碱基的新生的单链DNA，且无法与HVB‑cccDNA负链结合，也无法与HBV‑rcDNA的任一条链结合，从而仅对HBV‑cccDNA的正链进行选择性扩增，而不扩增HBV‑rcDNA，实现了在对HBV‑cccDNA的特异性检测中避免了HBV‑rcDNA的干扰。

主权项

1.一种基于通用碱基插入替换的HBV‑cccDNA特异性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：设计启动引物：所述启动引物与cccDNA正链配对，所述与cccDNA正链配对的序列位于HBV‑DNA序列中DR2区域的下游；第1步PCR反应：加入所述启动引物，以cccDNA正链为模板，开始单向PCR反应，得到新生的单链DNA分子；所述新生的单链DNA分子中常用碱基A、T、G、C中的一种被替换为通用碱基；所述的通用碱基是可以与至少两种常用碱基进行互补配对的碱基；设计选择引物：所述选择引物与新生的单链DNA分子的3’端配对，其对应的序列位于HBV‑DNA序列中DR2区域上游；第2步PCR反应：加入所述选择引物，对第1步PCR反应中所述新生的单链DNA分子进行选择性扩增，得到选择性扩增的产物；所述的选择引物能够与新生的单链DNA分子配对，但是不能与cccDNA的互补序列配对；定性或定量检测第2步PCR反应中所述的选择性扩增的产物。