[发明专利]一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法

摘要

本发明公开了一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法。通过质粒构建以及融合标签的使用，能够在细胞的胞液中的到大量的可溶性异戊烯基转移酶NovQ，之后经过一步纯化可以得到高活性的蛋白，提高了蛋白获取的效率。利用融合标签与NovQ蛋白共表达可以在不破坏酶结果的前提下得到纯度较高的酶蛋白。本发明相较于其他异戊烯基转移酶获取方法而言，有产量高，酶的提取和纯化方法简单等优势，在萜类的体外和体内生产过程中有广泛的应用前景。

主权项

1.一种表达芳香族异戊烯基转移酶的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：根据NCBI中查找到的MBP的序列，去掉终止密码子，在两端引入NcoI和HindIII两个酶切位点，设计得到引物，然后进行PCR扩增得到第一MBP片段；步骤2：根据NCBI中查找到的MBP的序列，保留终止密码子，在两端引入NdeI和KpnI两个酶切位点，设计得到引物，然后进行PCR扩增得到第二MBP片段；步骤3：使用限制性内切酶切割第一MBP片段和质粒pET28a，清洁回收后利用T4连接酶将第一MBP片段和质粒pET28a连接起来，得到载体pET28a‑MBP；使用限制性内切酶切割第二MBP片段和质粒pETDuet‑1，清洁回收后利用T4连接酶将第二MBP片段和质粒pETDuet‑1连接起来，得到载体pETDuet‑1‑MBP；步骤4：以链霉菌总DNA为模板，使用引物F3和R3进行PCR扩增，经PCR纯化试剂盒纯化后得到片段3；以链霉菌总DNA为模板，使用引物F4和R4进行PCR扩增，经PCR纯化试剂盒纯化后得到片段4；F3:5’CCCAAGCTTGAGAATCTTTATTTCCAAGGTTCTATGCCCGCACTCCCGATGAAT‑3’；R3:5’ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCGGGCACCTCCGGTGATC‑3’；F4:5’ ‑CATGCCATGGATGCCCGCACTCCCGATGAAT‑3’；R4:5’‑ CCCAAGCTTTCATCGGGCACCTCCGGTGATC‑3’；步骤5：使用限制性内切酶切割片段3和载体pET28a‑MBP，清洁回收后利用T4连接酶将片段3和载体pET28a‑MBP连接起来，得到芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pET28a‑MBP‑NovQ；使用限制性内切酶切割片段4和载体pETDuet‑1‑MBP，清洁回收后利用T4连接酶将片段4和载体pETDuet‑1‑MBP连接起来，得到芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pETDuet‑1‑MBP‑NovQ；步骤6：将芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pET28a‑MBP‑NovQ转化入大肠杆菌DH5α中，扩增获取表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到可溶性芳香族异戊烯基转移酶表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ，将芳香族异戊烯基转移酶促溶表达载体pETDuet‑1‑MBP‑NovQ导入大肠杆菌DH5α中，扩增获取表达载体，将所述表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到第二种可溶性芳香族异戊烯基转移酶表达菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)‑ pETDuet‑1‑MBP‑NovQ；步骤7：将大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ单菌落，接种于LB液体培养基，培养得到活化后的大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌液；吸取活化后的大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌液接种于新的LB液体培养基中，培养至菌液OD值为0.6‑0.8，得到大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ诱导前菌液；向所述大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ诱导前菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，振荡培养3‑4h后对发酵液离心除去培养基，得到大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌体；向所述BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌体中加入PBS缓冲液，重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，得到的破碎液离心20min弃沉淀，得到的上清液即为含有MBP‑NovQ融合蛋白的溶液；使用直链淀粉柱纯化含有MBP‑NovQ融合蛋白的溶液，即得MBP‑NovQ纯酶溶液；步骤8：将大肠杆菌Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ单菌落，接种于LB液体培养基，培养得到活化后的大肠杆菌Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ菌液；吸取活化后的大肠杆菌Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ菌液接种于新的LB液体培养基中，培养至菌液OD值为0.6‑0.8，得到大肠杆菌Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ诱导前菌液；向所述大肠杆菌Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ诱导前菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，振荡培养3‑4h后对发酵液离心除去培养基，得到大肠杆菌Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ菌体；向所述Rosetta(DE3)‑pETDuet‑1‑MBP‑NovQ菌体中加入PBS缓冲液，重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，得到的破碎液离心弃沉淀，得到的上清液即为含有可溶性NovQ蛋白的溶液；使用Ni‑NT resin纯化含有NovQ蛋白的溶液，即得NovQ纯酶溶液；步骤9：将大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ单菌落，接种于LB液体培养基，培养得到活化后的大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌液；吸取活化后的大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌液接种于新的LB液体培养基中，培养至菌液OD值为0.6‑0.8，得到大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ诱导前菌液；向所述大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ诱导前菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，振荡培养3‑4h后对发酵液离心除去培养基，得到大肠杆菌BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌体；向所述BL21(DE3)‑pET28a‑MBP‑NovQ菌体中加入PBS缓冲液，重悬菌体，然后使用超声破碎仪破碎细胞，得到的破碎液离心20min弃沉淀，得到的上清液即为含有MBP‑NovQ融合蛋白的溶液；使用直链淀粉柱纯化含有MBP‑NovQ融合蛋白的溶液，且在纯化过程中加入TEV蛋白酶，得到酶切过的NovQ纯酶溶液。