[发明专利]一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法

摘要

一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，先对提取的DNA进行含量的鉴定；再分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，借助实时荧光定量PCR MGB探针法分别对性别位点A和B进行扩增和鉴定；本发明设定两种性别扩增基因相结合，两种性别基因鉴定结果可以互相补充和验证，大大增加了古代人类遗骸性别鉴定结果的可靠性；本发明方法所用的古DNA模板量较少，只要1.5μl就可以完成模板定量两种性别基因鉴定整个过程；实时荧光定量PCR技术的应用，相对于传统PCR扩增和凝胶电泳验证步骤，缩短了实验时间和减少了操作步骤，提高了检测灵敏性和效率。

主权项

1.一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、古DNA的提取步骤二、古DNA的定量选择人类线粒体DNA序列，设计一段113bp长的DNA片段，并设计好探针，同时合成引物和探针，如表1，表1古DNA的定量引物制备标准品包括：PCR扩增目标片段，PCR产物的纯化，重组质粒的转染，菌落PCR，菌落PCR成功的细菌进行恒温培养，摇菌过夜，质粒的提取，保准品制备完成；用实时荧光定量PCR SYBR方法对标准品和古DNA样品进行扩增，根据标准品的扩增结果，绘制标准曲线，进而计算古DNA样品绝对定量结果；步骤三、性别位点A引物的合成Amelogenin基因通常在X和Y染色体上分布的片段长度不同，电泳后出现106bp和112bp两条带的是男性，只出现106bp一条带的是女性，合成引物见表2；表2 Amelogenin基因扩增引物步骤四、性别位点B引物的合成用3个特异性性别引物分别对样本X和Y染色体片段进行扩增，引物M4作用于X和Y染色体5'端；引物M5只作用于X染色体3'端；而M6仅作用于Y染色体3'端；X染色体扩增产物片段大小为330bp；Y染色体扩增产物片段大小为218bp，引物M4、M5和M6序列见表3；表3性别基因扩增引物步骤五、两对性别位点的结合：分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，将性别位点A和B进行整合，作为古代人类遗骸性别鉴定的Markers；步骤六、性别位点A和B的扩增和鉴定合成MGB探针，用实时荧光定量PCR探针法，使用NEB Luna Universal Probe Qpcr Master Mix，M3004，同时对性别位点A和B进行扩增，将性别位点A和B的扩增结果放在一起综合分析，最后得到古人类遗骸个体性别信息。