[发明专利]一种检测肺炎链球菌的RCA方法

摘要

本发明公开了一种检测肺炎链球菌的RCA方法，按照如下步骤完成：（1）标本DNA的提取；（2）捕获探针的杂交，（3）锁式探针的环化连接与酶切，（4）RCA扩增，再用琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测肺炎链球菌的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，RCA扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在细菌检测方面具有独特优势。

主权项

1.一种检测肺炎链球菌的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：(1)将待测标本按Qiagen公司的细菌DNA提取试剂盒步骤处理，获得含肺炎链球菌的基因组DNA样品；(2)捕获探针的杂交：在反应管中依次加入含肺炎链球菌的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针，充分混匀，55±1℃水浴杂交，杂交完成后自然冷却至室温，加入溶于2×结合缓冲液的链霉亲和素包被的磁珠，混匀，室温放置，磁性分离，用1×结合缓冲液清洗磁珠数次，弃去洗液，得到杂交产物；(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer，轻轻混匀，在95±1℃下反应3‑5min，然后再在45±1℃下孵育后，加入10×BSA缓冲液和E.coli DNA连接酶，混匀，在37±1℃进行环化连接反应；反应完成后加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，混匀，在37±1℃反应，反应完成后在95±1℃下条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，得到探针环化连接产物；(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物、加入引物和10×phi29 Buffer，混匀后在95±1℃下反应3‑5min，然后进行冰浴；再加入phi29DNA聚合酶、dNTPs液，混匀后在37±1℃进行RCA反应，得到扩增产物；(5)取步骤(4)制得的扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳，有肉眼可见条带扩增出来的为肺炎链球菌阳性，反之为肺炎链球菌阴性，即可完成对肺炎链球菌的检测；所述步骤(4)中所设计用于RCA反应的引物是：5’‑CATACTCTATTAGTATTATAATGTGCTCGATCGACAGCTTATA‑3’ SEQ NO1；所述步骤(2)中的锁式探针为：5’‑TGCCTTTCAATGCAGATAAGTATCTAGAGGATAAACGAGGTAGACGAAGCAATTACCGCCCGGAACCAACAGGGACAACACCATAGGCAATTCTCCTTATTCC‑3’探针的5’端进行磷酸化修饰 SEQ NO2；所述步骤(2)中的捕获探针为：Biotin‑CATACTCTATTAGTATTATCTTAGCCCAAAACATGTAAGTCCCACCACACTTAT SEQ NO3。