[发明专利]ATP生物荧光lgCA-lgIA标曲法评价液体消毒剂细菌杀灭效果的方法

摘要

本发明涉及一种液体消毒剂细菌繁殖体杀灭效果评价方法，检测步骤包括：样品提取及最低有效浓度确定；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；ATP浓度对数值lgC_A‑相对荧光强度对数值lgI_A标曲建立及接种菌液活菌ATP浓度C_A标定；中和剂鉴定及定量悬液试验；回收液I_A测定及其活菌ATP浓度C_A和T_A推算；杀灭率R及灭菌指数A计算；结果判定；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的消毒剂细菌繁殖体杀灭效果进行精准定量评价。本发明规定回收作用不同时间后的试验样液和对照样液，测定其I_A并以lgI_A表征和计算R或A；提供结果判定依据。本发明研发的消毒剂细菌繁殖体杀灭效果评价的ATP生物荧光lgC_A‑lgI_A标曲法，可完善消毒效果评价方法体系。

主权项

1.一种液体消毒剂细菌繁殖体杀灭效果的评价方法，包括：(1)样品提取及消毒剂最低有效浓度确定；(2)设备选型及试剂、培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)ATP浓度对数值lgC_A‑相对荧光强度对数值lgI_A标准曲线建立及接种菌液的活菌ATP浓度C_A标定；(5)中和剂鉴定及定量悬液试验；(6)回收液相对荧光强度值I_A测定；(7)回收液活菌ATP浓度C_A和T_A推算及杀灭率R和灭菌指数A计算；(8)结果判定；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以杀灭率R或灭菌指数A表征的液体消毒剂细菌繁殖体杀灭效果进行精准定量评价的ATP生物荧光lgC_A‑lgI_A标准曲线法，具体的：在回收液相对荧光强度值I_A测定中：明确样品提取要求，确定消毒剂10min内抑杀指示菌的最低有效浓度，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液并对其菌数进行初筛，用指示菌种培养液将1.0×10^‑3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：8.5×10^‑9mol/L、8.5×10^‑8mol/L、8.5×10^‑7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10^‑7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为8.5×10^‑10mol/L、8.5×10^‑9mol/L、8.5×10^‑8mol/L)和1.0×10^‑11mol/L、1.0×10^‑10mol/L、1.0×10^‑9mol/L，并测定其相对荧光强度值I_A；绘制两条相应浓度的lgC_A‑lgI_A标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝a_A0X+b_A0(高浓度)、Y＝a_AX+b_A(低浓度)和线性相关系数R_A0²(高浓度)、R_A²(低浓度)，对细菌总量为6.0×10⁸CFU/mL的菌悬液进行连续10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值I_A，根据高浓度曲线方程式Y＝a_A0X+b_A0推算相应的活菌ATP浓度C_A；经调整得到C_A范围为8.0×10^‑8mol/L～9.0×10^‑8mol/L的接种菌液，然后，以待测消毒剂的最低有效浓度进行中和剂鉴定试验，确定中和剂种类及浓度；同时将3.5mL不同浓度的试验样液和对照样液置于(20±2)℃水浴中并使其与0.5mL接种菌液混合；待灭菌作用持续t₁、t₂、t₃、t₄四段不同时间后，将0.4mL染菌样液分别与3.6mL中和剂溶液混合，中和作用进行10min后将其混匀液作为回收液；应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值和并根据低浓度标准曲线方程式Y＝a_AX+b_A推算相应的活菌ATP浓度和在杀灭率R或灭菌指数A计算中：根据ATP低浓度标准曲线lgC_A‑lgI_A的线性方程式Y＝a_AX+b_A，针对t₁、t₂、t₃、t₄四段不同灭菌时间，以每次定量悬液试验中各浓度试验样液及对照样液回收活菌的相对荧光强度测定值作为基础数据；计算其对细菌繁殖体的杀灭率或灭菌指数并取其五次试验的算术平均值作为相应浓度待测液体消毒剂样品在相同灭菌时间内对细菌繁殖体的杀灭率或灭菌指数同时明确相关数据修约和测量不确定度要求；在结果判定中：参考卫生行业通用做法和相关消毒效果生物学评价标准，如果某浓度待测液体消毒剂样液在单次定量悬液试验中，经ATP生物荧光lgC_A‑lgI_A标准曲线法测得的特定灭菌时间内细菌繁殖体杀灭率≥99.9％或灭菌指数≥3.0，则判定其在此次试验中消毒效果合格，当该浓度待测液体消毒剂样液在5次定量悬液试验中相同灭菌时间内的消毒效果均合格时，方可确定其对细菌繁殖体具有消毒效果的最低浓度和最短时间(在实际应用中以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为待测液体消毒剂样品达到实用消毒效果所需的浓度和时间)。