[发明专利]一种检测遗传性高度近视基因21个突变位点的方法

摘要

本发明公开了一种检测高度近视21个热点突变位点的方法，针对人高度近视的十种致病基因OPN1LW、SCO2、ZNF644、CCDC111、LRPAP1、SLC39A5、P4HA2、ARR3、BSG和P3H2中的21个热点突变，该检测方法是以基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱技术检测基因组DNA，通过扩增21个高度近视相关的SNP位点，再进行单碱基延伸，使在SNP位点上延伸1个碱基。由于离子的质量不同，其在真空小管中飞行的时间长短也不同，借以来判断离子质量的大小，从而判断位点的基因型。

主权项

1.一种检测遗传性高度近视基因21个突变位点的方法，包括如下步骤：S1、全血提取基因组DNA；S2、对步骤S1提取的基因组DNA进行PCR扩增反应；PCR扩增引物为：针对OPN1LW基因上的rs145009674(c.532A>G；p.Ile178Val)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTGAGATTTGATGCCAAGCTG‑3’(SEQ ID NO:01)5’‑ACGTTGGATGACCTGCTCCAACCAAAGATG‑3’(SEQ ID NO:02)针对OPN1LW基因上的rs949431(c.538T>G；p.Ser180Ala)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGATCGTGGGCATTGCCTTCTC‑3’(SEQ ID NO:04)5’‑ACGTTGGATGCTTACCTGCTCCAACCAAAG‑3’(SEQ ID NO:05)针对SCO2基因上的rs74315510(c.157C>T；p.Gln53Ter(Q53X))位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGATCAGCAGCCGGGTTCGAAG‑3’(SEQ ID NO:07)5’‑ACGTTGGATGATCTGAGGTCCTGGCTTTTG‑3’(SEQ ID NO:08)针对ZNF644基因上的rs387907109(c.2014A>G；p.Ser672Gly)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTTCTGTATTCTGTGTGGCCG‑3’(SEQ ID NO:10)5’‑ACGTTGGATGGATGTGAAGCGAACATTTGG‑3’(SEQ ID NO:11)针对CCDC111基因上的rs200857997(c.265T>G；p.Tyr89Asp)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGCCTTGTGACAACCTATGCTG‑3’(SEQ ID NO:13)5’‑ACGTTGGATGGTTCTGCTGCATGCTACCTA‑3’(SEQ ID NO:14)针对LRPAP1基因上的rs786205127(c.605delA；Asn202ThrfsTer8)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTTCTCCTTCAGCTCCGTGTG‑3’(SEQ ID NO:16)5’‑ACGTTGGATGTCCTGCCTTCGGTTTTACAG‑3’(SEQ ID NO:17)针对LRPAP1基因上的rs786205216(c.199delC；Gln67SerfsTer8)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGCTCCAACGACCCCAACCAC‑3’(SEQ ID NO:19)5’‑ACGTTGGATGCATGGAGAAGTTGAACCAGC‑3’(SEQ ID NO:20)针对SLC39A5基因上的rs199624584(c.141C>G；p.Tyr47X)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGAGCAGGAGCAGAACCATTAC‑3’(SEQ ID NO:22)5’‑ACGTTGGATGCTGCAGTCAGCGTCCCATT‑3’(SEQ ID NO:23)针对SLC39A5基因上的rs587777625(c.911T>C；p.Met304Thr)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTCTTCCTGCTCTTTGTGCTG‑3’(SEQ ID NO:25)5’‑ACGTTGGATGAAAGGGTATCACTCACTGGC‑3’(SEQ ID NO:26)针对P4HA2基因上的rs758872875(c.871G>A；p.Glu291Lys)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGATCTCACCAGTTTGACACCC‑3’(SEQ ID NO:28)5’‑ACGTTGGATGATGAGAGGCCTGTGGACTAC‑3’(SEQ ID NO:29)针对P4HA2基因上的rs764211125(c.419A>G；p.Gln140Arg)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTTCCCCTCTGGAAATTGTGC‑3’(SEQ ID NO:31)5’‑ACGTTGGATGCACTGATGAGGACGAGATAG‑3’(SEQ ID NO:32)针对P4HA2基因上的rs1135402746(c.1349_1350delGT；Arg451GlyfsTer8)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGCAGCACACATCATACTCACG‑3’(SEQ ID NO:34)5’‑ACGTTGGATGTTCAAGCATTTAGGGACGGG‑3’(SEQ ID NO:35)针对ARR3基因上的rs765658563(c.893C>A；p.Ala298Asp)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGGGCACTGGATGGCAAACTTA‑3’(SEQ ID NO:37)5’‑ACGTTGGATGGGAAATGGAGGCTGAGAGTT‑3’(SEQ ID NO:38)针对ARR3基因上的rs769923269‑1bp(c.298C>T；p.Arg100X)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGCAAGTGGTCCCAGCTGAATC‑3’(SEQ ID NO:40)5’‑ACGTTGGATGCATTGTCCCCTAGCTTGTGC‑3’(SEQ ID NO:41)针对ARR3基因上的rs777729215+1bp(c.239T>C；p.Leu80Pro)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTGGTCTGACGTTCCGAAAAG‑3’(SEQ ID NO:43)5’‑ACGTTGGATGTGCAGTAGTCGCTCCTGTAG‑3’(SEQ ID NO:44)针对BSG基因上的rs757777232(c.889G>A；p.Gly297Ser)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTTGAGAACCTGAACATGGAG‑3’(SEQ ID NO:46)5’‑ACGTTGGATGTGATGATGGCCTGGTCGGAG‑3’(SEQ ID NO:47)针对BSG基因上的rs530538042+2bp(c.661C>T；p.Pro221Ser)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGTTCCAGGCTCCTCTCTCTC‑3’(SEQ ID NO:49)5’‑ACGTTGGATGCGTTGATGTGTTCTGACGAC‑3’(SEQ ID NO:50)针对BSG基因上的rs776735964+1bp(c.415+1G>A；Splice donor)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGCCCAGGCAGTCGTGCTAGT‑3’(SEQ ID NO:52)5’‑ACGTTGGATGTCTGGGTTCTACTGAGCAGG‑3’(SEQ ID NO:53)针对BSG基因上的rs764410306+2bp(c.205C>T；p.Gln69X)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGATCCAGTGGTGGTTTGAAGG‑3’(SEQ ID NO:55)5’‑ACGTTGGATGTAGGTGGCGTGGATGTGGAC‑3’(SEQ ID NO:56)针对P3H2基因上的：rs724159988(c.1523G>T；p.Gly508Val)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGAGGCTGACACTAAGGAACTC‑3’(SEQ ID NO:58)5’‑ACGTTGGATGCCCATACACCCAATGAAAAG‑3’(SEQ ID NO:59)针对P3H2基因上的rs724160006(c.13C>T；p.Gln5X)位点，PCR扩增引物是：5’‑ACGTTGGATGATGCTTCAACACCAGCTGT‑3’(SEQ ID NO:61)5’‑ACGTTGGATGTTTTCGTGGCTAACCCTGAG‑3’(SEQ ID NO:62)S3、对经过PCR扩增反应的基因组DNA进行单碱基延伸反应；采用的单碱基延伸反应引物为：针对OPN1LW基因上的rs145009674(c.532A>G；p.Ile178Val)位点，单碱基延伸引物是：5’‑CACAGCAGCCCAGA‑3’(SEQ ID NO:03)针对OPN1LW基因上的rs949431(c.538T>G；p.Ser180Ala)位点，单碱基延伸引物是：5’‑CTGTCCACACAGCAG‑3’(SEQ ID NO:06)针对SCO2基因上的rs74315510(c.157C>T；p.Gln53Ter(Q53X))位点，单碱基延伸引物是：5’‑GGCAGGGCCAGCCC‑3’(SEQ ID NO:09)针对ZNF644基因上的rs387907109(c.2014A>G；p.Ser672Gly)位点，单碱基延伸引物是：5’‑TTTGGATCAACCTCACAATCA‑3’(SEQ ID NO:12)针对CCDC111基因上的rs200857997(c.265T>G；p.Tyr89Asp)位点，单碱基延伸引物是：5’‑ATGCTACCTACCTGGATTTATAGT‑3’(SEQ ID NO:15)针对LRPAP1基因上的rs786205127(c.605delA；Asn202ThrfsTer8)位点，单碱基延伸引物是：5’‑AGGGGCTAATGACGT‑3’(SEQ ID NO:18)针对LRPAP1基因上的rs786205216(c.199delC；Gln67SerfsTer8)位点，单碱基延伸引物是：5’‑CGCGCTCACTCGCTGG‑3’(SEQ ID NO:21)针对SLC39A5基因上的rs199624584(c.141C>G；p.Tyr47X)位点，单碱基延伸引物是：5’aAGCGTCCCATTCTCGCC‑3’(SEQ ID NO:24)针对SLC39A5基因上的rs587777625(c.911T>C；p.Met304Thr)位点，单碱基延伸引物是：5’‑ggTTTGTGCTGGAGAACA‑3’(SEQ ID NO:27)针对P4HA2基因上的rs758872875(c.871G>A；p.Glu291Lys)位点，单碱基延伸引物是：5’‑gTGCCTGAGAGGGATGTTTAC‑3’(SEQ ID NO:30)针对P4HA2基因上的rs764211125(c.419A>G；p.Gln140Arg)位点，单碱基延伸引物是：5’‑ggccAAGCCCTGATGAGACTTC‑3’(SEQ ID NO:33)针对P4HA2基因上的rs1135402746(c.1349_1350delGT；Arg451GlyfsTer8)位点，单碱基延伸引物是：5’‑GGGACGGGGAATCGTG‑3’(SEQ ID NO:36)针对ARR3基因上的rs765658563(c.893C>A；p.Ala298Asp)位点，单碱基延伸引物是：5’‑ccTGAAGATACCAACCTGG‑3’(SEQ ID NO:39)针对ARR3基因上的rs769923269‑1bp(c.298C>T；p.Arg100X)位点，单碱基延伸引物是：5’‑TCACAGTCCTACAGGAG‑3’(SEQ ID NO:42)针对ARR3基因上的rs777729215+1bp(c.239T>C；p.Leu80Pro)位点，单碱基延伸引物是：5’‑TCTGTATGTGCAGACCC‑3’(SEQ ID NO:45)针对BSG基因上的rs757777232(c.889G>A；p.Gly297Ser)位点，单碱基延伸引物是：5’‑TTGCACCGGTACTGGC‑3’(SEQ ID NO:48)针对BSG基因上的rs530538042+2bp(c.661C>T；p.Pro221Ser)位点，单碱基延伸引物是：5’‑TCCTGTCAGGGCCT‑3’(SEQ ID NO:51)针对BSG基因上的rs776735964+1bp(c.415+1G>A；Splice donor)位点，单碱基延伸引物是：5’‑ccttaGTGCTAGTCCTGGAAC‑3’(SEQ ID NO:54)针对BSG基因上的rs764410306+2bp(c.205C>T；p.Gln69X)位点，单碱基延伸引物是：5’‑cccttCGCCGTCCCAGAGCT‑3’(SEQ ID NO:57)针对P3H2基因上的：rs724159988(c.1523G>T；p.Gly508Val)位点，单碱基延伸引物是：5’‑ACCCAATGAAAAGTTTGAAG‑3’(SEQ ID NO:60)针对P3H2基因上的rs724160006(c.13C>T；p.Gln5X)位点，单碱基延伸引物是：5’‑cGCACATGGAAATGCAG‑3’(SEQ ID NO:63)S4、通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法，对步骤S3得到的单碱基延伸反应产物进行数据监测并分析各突变位点的基因型。