[发明专利]一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A;Cel7A的构建方法在审
| 申请号： | 201910235078.4 | 申请日： | 2019-03-26 |
| 公开（公告）号： | CN109797160A | 公开（公告）日： | 2019-05-24 |
| 发明（设计）人： | 钟成;舒月力;李栋梁 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/56 | 分类号： | C12N15/56;C12N15/81;C12N9/42;C12R1/84 |
| 代理公司： | 北京瑞盛铭杰知识产权代理事务所(普通合伙) 11617 | 代理人： | 郑海松 |
| 地址： | 300457 天津市滨*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | 本发明的目的在于构建一种异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A重组毕赤酵母,具体步骤如：(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:固体诱导培养基获得菌丝体，试剂盒提取总RNA和cDNA；(2)目的基因的克隆:用合理引物PCR扩增出目的基因；(3)构建表达载体:以Ppic9k为载体,将目的基因插入启动子AOX1下游,5'和3'端酶切位点分别为EcoRⅠ，NotⅠ；(4)获取重组菌株:以SalⅠ为线性化位点,实现表达载体线性化,电转，得到重组酵母；(5)重组菌株的诱导产酶：摇瓶发酵，用适当甲醇诱导产酶；(6)重组蛋白活性检测：利用SDS‑PAGE及刚果红‑CMC检测重组蛋白的表达量及活性。本方法构建的重组菌株能高效表达带his标签的蛋白，能得到高效单酶组分。 | ||
| 搜索关键词： | 目的基因 重组菌株 构建 外切葡聚糖酶 异源表达 重组蛋白 线性化 固体诱导培养基 构建表达载体 重组毕赤酵母 提取总RNA 毕赤酵母 表达载体 高效表达 活性检测 甲醇诱导 里氏木霉 酶切位点 摇瓶发酵 诱导产酶 重组酵母 表达量 刚果红 菌丝体 启动子 试剂盒 产酶 单酶 电转 位点 引物 蛋白 克隆 检测 | ||
【主权项】：
1.一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，包括以下步骤：(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养,直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；(2)目的基因的克隆:利用合理同源引物，合适条件，PCR扩增出Cel6A,Cel7A的基因；(3)构建表达载体:以Ppic9k质粒为载体,将Cel6A,Cel7A基因插入启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k‑Cel6A,Cel7A表达载体；(4)获取重组菌株:以SalⅠ为Ppic9k‑Cel6A,Cel7A表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,然后通过电转化转入毕赤酵母，得到Cel6A,Cel7A的重组酵母；(5)重组菌株的诱导产酶：将筛选后的菌株，摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；(6)重组蛋白活性检测：刚果红‑CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶；SDS‑PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量。
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