[发明专利]基于酚类物质和氨基酸区分紫果种和黄果种百香果的方法

摘要

本发明公开了一种基于酚类物质和氨基酸区分紫果种和黄果种百香果的方法，其是以百香果果皮中没食子酸、绿原酸、异荭草苷、咖啡酸、丁香酸、荭草苷等18种酚类化合物含量，及天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸等百香果果肉中17种氨基酸含量为指标建立样本矩阵，应用聚类分析法进行计算，以实现紫色百香果和黄金百香果的有效区分，为紫果种与黄果种分类提供一个客观、可靠的方法。

主权项

1.一种基于酚类物质和氨基酸区分紫果种和黄果种百香果的方法，其特征在于：包括以下步骤：一、样品预处理：将百香果果皮及果肉分别干燥、粉碎后，过60目筛，得百香果果皮粉末和百香果果肉粉末；二、果皮中酚类物质的测定：1）样品溶液的制备：称取0.5g百香果果皮粉末，加入5mL纤维素酶和果胶酶混合溶液，静置20min，灭酶后加入15mL、70wt.%甲醇溶液加热提取6min，离心分离；重复提取两次后，合并上清，加70wt.%甲醇溶液定容至50mL，10000r/min离心，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，得样品溶液；2）混合标样的配制：将没食子酸、绿原酸、异荭草苷、咖啡酸、丁香酸、荭草苷、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、芥子酸、牡荆素、异牡荆素、白皮杉醇、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚的标准品用70 wt.%甲醇溶液分别配制成浓度为1mg/mL的标准液，经稀释、混合，得混合标样，于‑20℃保存备用；3）色谱检测：使用由四元泵、柱温箱、DAD检测器以及工作站所组成的HPLC仪器进行检测；其检测条件为：采用C₁₈色谱柱，柱温为30℃，进样量为5‑20μL，以乙腈‑1wt.%乙酸溶液为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0‑70min，乙腈与1wt.%乙酸溶液的体积比由5:95增加至50:50，流动相流速为1.0mL/min，检测时间为70min；DAD检测波长为280~350nm，荧光检测Ex=235~340nm，Em=345~450nm；三、果肉中氨基酸的测定：1）样品提取液的制备：将1mL 4℃的20mM HCl加入到0.5g百香果果肉粉末中，室温下涡旋震荡20min后，以13000r/min离心10min；加入20mM HCl重复提取2次，将上清液合并后加入10μL 25mM正亮氨酸作为内部定量标准，通过0.4mm滤膜过滤进入Eppendorf管并在‑20℃下放置过夜；2）氨基酸混合标样的配制：分别准确称取天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬草氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸各0.0001g，用8.3mL 6mol/L的盐酸溶液溶解后定容至10mL，混匀，得氨基酸混合标样；3）衍生化：使用Acc Q·Fluor试剂盒对样品提取液及氨基酸混合标样进行衍生化；4）色谱检测：使用Waters高效C₁₈色谱柱，规格为250 mm×4.6 mm，粒径4 μm，柱温：30℃；流动相：Waters Acc Q·Tag Eluent A浓液经超纯水稀释稀释100 倍作为A相、70vol%乙腈作为B相进行线性梯度洗脱，洗脱程序为：0‑30min，B相体积由0%增至50%；30‑34min，B相体积保持为50%，34min‑35min，B相体积由50%降至40%；35‑40min，B相体积由40%降至0%，40‑45min，保持B相体积为0%；流速为0.8 mL/min；激发波长250 nm，发射波长395 nm；进样量10 μL；四、以所测定的样品果皮中18种酚类物质的含量和果肉中17种氨基酸的含量为指标建立样本矩阵，应用聚类分析法计算品种百香果标准样之间的平方欧氏距离，获得标准样的平方欧氏距离范围，再测定待测样品的区分因子的特征成分含量，分别计算其与标准样的平方欧氏距离范围，以判定待测样品的种类。