[发明专利]一种卡介苗PhoPR基因过表达菌株的构建及其用途

摘要

本发明涉及构建一种新型PhoPR基因过表达的卡介苗（BCG）突变菌株及其用途。首次将含有BCG过表达PhoPR基因的载体转化入BCG，筛选并检测确定成功转化的菌株为新型PhoPR基因过表达的卡介苗（BCG）突变菌株。本发明涉及新型PhoPR基因过表达的卡介苗（BCG）突变菌株，即BCG：PhoPR菌株，该类菌株主要用于研究卡介苗PhoPR基因过表达的相关蛋白PhoPR在结核分枝杆菌在宿主内的生长、耐药性、渗透性调节、耐酸性、致病性等方面的作用，以及用于干预和治疗结核病的新型疫苗开发和研究。

主权项

1.一种卡介苗过表达PhoPR基因菌株的构建，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、BCG的培养及其菌悬液的构建，取对数生长期BCG菌液10mL，调整细菌浓度为3.5×107个/mL，3500r/min 离心5min，弃上清收集菌体, 用PBS洗涤两次，加入1ml 37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/L；步骤2、根据BCG菌株设计引物；PhoPR1：ACGCAATTGGCTGATTTGGCGATTCCTG，PhoPR2：CGTAAGCTTCTTGACGATTGAGCCGATGA；步骤3、目的基因的PCR扩增及PCR扩增产物的回收，以BCG为模版并以引物PhoPR1、PhoPR2扩增PhoPR基因，扩增产物长度为2634bp，扩增产物利用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并命名为PhoPR，回收PCR扩增产物，分离DNA溶液；步骤4、目的基因与T载体的连接、并转化到E.coli DH5α感受态细胞，回收后的PCR产物（PhoPR基因片段）与T载体连接；将10μl PCR回收产物（PhoPR）与T载体的连接液加入到100μl E.coli DH5α感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴10min；加入800μl不含抗生素的LB液体培养基；150rpm/min摇床37℃震荡培养45min，3,000rpm离心20s，弃部分上清，仅留150μl液体重悬菌体，用无菌涂布棒涂布于含有0.05g/L Kana的LB平板上，先正置30min使菌液吸收完全，再置于37℃培养箱倒置培养过夜；步骤5、阳性转化子的PCR鉴定，并命名T‑PhoPR，在超净台中挑取LB平板中的若干个单菌落，至于EP管中，向其中加入LB液体培养基，摇床37℃震荡培养3h，做菌液PCR反应；反应完成后对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析筛选出阳性克隆，命名为T‑PhoPR；步骤6、目的质粒的提取和测序鉴定，由上海生工生物有限公司测序，阳性克隆菌液保菌并送至上海生工生物有限公司测序；步骤7、构建及鉴定重组穿梭质粒pMV361‑PhoPR；利用限制性内切酶Mun I / Hind III酶切T‑PhoPR及pMV361质粒，将酶切产物经1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的条带，回收后的T‑PhoRR及pMV361质粒于4℃连接过夜，发生连接反应，然后，转入E.coli DH5α感受态细胞利用PCR筛选阳性单克隆，并命名为pMV361‑PhoPR；步骤8、利用电穿孔技术将重组穿梭质粒pMV361‑PhoPR电转化至BCG菌株，将10μl重组穿梭质粒pMV361‑PhoPR与100μl新鲜构建的BCG菌株感受态细胞混匀，冰上放置30min后转移到预冷的1mm电击杯中，于2.1‑2.5Kv/cm条件下脉冲后迅速转至含5mL 7H9液体培养基（无Kana）的试管中37℃培养48h，离心收集菌体后余100μl上清悬浮菌体，涂至含0.03mg/L Kana的L‑J培养基，37℃培养3‑4周，进行抗性筛选，并命名为过表达pMV361‑PhoPR：BCG。