[发明专利]一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法

摘要

本发明涉及一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法，涉及微生物高通量测序领域。该方法首先将随机碱基组成的特异性标签序列(UMI)加在每个16S rDNA模板分子两端，经PCR扩增得到多个拷贝的两端含特定UMI的16S rDNA全长扩增子，通过随机打断并连接上测序文库的接头，经双端测序获得UMI序列和相应的16S rDNA片段序列；另外，通过环化16S rDNA全长扩增子和测序，获得同一分子两端的UMI配对信息；根据相同UMI和配对UMI信息进行reads的组装，从而增加拼接长度，最终组装得到16S rDNA全长序列信息。本发明提供的方法成本低、准确度高，适用于高通量测序平台；同时该方法通过UMI可有效排除PCR扩增偏好性、扩增错误和测序错误的影响，从而更加精确地定量样本中的细菌种群丰度。

主权项

1.一种用于构建细菌16S rDNA全长高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取样本中的细菌基因组DNA：采集环境样本，提取样本中的细菌基因组DNA；2)在每个16S rDNA模板分子两端分别加上不同的UMI标记：首先经过两轮独立的退火、延伸步骤，将随机碱基组成的特异性标签序列(Unique Molecular Identifier,UMI)加在每个16S rDNA模板分子两端，然后经PCR扩增得到多个拷贝的两端含不同UMI标记的16S rDNA全长扩增子；3)构建16S rDNA全长文库：包括含单端UMI序列的文库和含双端UMI序列的文库的构建；3a)构建含单端UMI序列的文库：将步骤2)得到的16S rDNA全长扩增子，使用含P7序列和生物素(Biotin)修饰的上下游引物进行PCR扩增，得到两端含P7序列且含Biotin修饰的产物，将产物进行随机片段化并切胶回收500～1000bp的DNA片段，特异性富集含Biotin标记的DNA片段，进行末端缺口补齐修复，并将修复的DNA片段的3’端加上脱氧腺苷酸A，并与3’端带有突出的脱氧胸苷酸T的P5接头连接，经PCR扩增后，纯化回收产物，即得到含单端UMI序列的文库，其结构特点是含左端UMI和16S rDNA中间序列的片段，或含右端UMI和16S rDNA中间序列的片段；3b)构建含双端UMI序列的文库：将步骤2)得到的16S rDNA全长扩增子，在3’端加上脱氧腺苷酸A，并与含biotin修饰且3’端带有突出“T”碱基的接头连接，经环化反应形成含biotin修饰的环状DNA分子；在DNA外切酶的作用下，去掉未环化的DNA分子；将环状DNA产物随机打断得到300‑1000bp的DNA片段，特异性富集含Biotin标记的DNA片段，通过末端修复、加A、加标签接头、PCR扩增，即得到含双端UMI序列的文库，其结构特点是包含左右两端UMI序列的配对信息；3c)将步骤3a)和3b)得到的含单端UMI序列的文库和含双端UMI序列的文库按照一定的质量比进行混合，即为待测的16S rDNA全长文库；4)高通量测序：将16S rDNA全长文库在高通量测序平台进行测序，测序类型为2×150bp的双端测序；5)生物信息分析：将测序数据进行过滤质控、根据UMI信息进行数据拆分、序列拼接、OTU聚类和注释、组内组间统计比较分析，多角度度量样本的微生物群落特征。