[发明专利]紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法

摘要

本发明公开了一种紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，包括下列步骤：（一）菌种培养，（二）mokH缺失菌株构建。本发明成功构建了mokH缺失菌株，对于探究mokH基因在紫色红曲菌中的作用提高了研究基础。

主权项

1.紫色红曲菌mokH基因缺失菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：(一)菌种培养菌株培养：将M1菌株在马铃薯固体培养基上活化2代，取适量菌液接种到种子培养基中，30℃、200r/min培养2d，按10％的接种量将种子液接种到发酵养基中，30℃、150r/min培养2d，再25℃、150r/min培养13d；(二)mokH缺失菌株构建从紫色红曲菌M1基因组中克隆mokH基因，将mokH基因酶切回收后连接到pUC18质粒上，再以pCAMBIA302质粒为模版克隆CaMV35S启动子及潮霉素B抗性基因，将带有启动子的潮霉素B抗性基因插入到pUC18‑mokH重组质粒的mokH中，从而构建置换型打靶载体pUC18‑mokH‑hph，并采用REMI转化法将打靶载体转化到紫色红曲菌M1原生质体中，使其与紫色红曲菌M1基因组DNA发生置换型同源重组，将潮霉素B基因整合到基因组上，使mokH基因失活，从而构建mokH基因缺失株。克隆mokH基因的具体步骤是：根据紫色红曲菌M1基因组DNA浓度将其稀释10倍后作为模版来扩增mokH基因；mokH基因的扩增所需PCR反应体系和条件如下：mokH基因的PCR反应体系PCR反应体系体积PrimeSTAR Max Premix(2X)12.5μLmokH‑F1μLmokH‑R1μLM1基因组DNA1μLddH₂O9.5μL总体系25μLPCR反应条件：克隆CaMV35S启动子及潮霉素B抗性基因，hph基因的扩增所需PCR反应体系和条件如下：hph基因PCR反应体系PCR反应体系体积2×Taq PCR mix25μLhph‑H‑F1μLhph‑H‑R1μLpCAMBIAl3O2质粒2μLddH₂O21μL总体系50μLPCR反应条件：所使用的引物序列如下：PrimerSequence(5’‑3’)mokH‑FGCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT(XbaI)mokH‑RCCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT(HindIII)hph‑H‑FACGCGTCGACGTTTGCGTATTGGCTAGAGC(SalI)hph‑H‑RACGCGTCGACTAATTCGGGGGATCTGGATTT(SalI)hph‑F(未带启动子)ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGChph‑R(未带启动子)CTATTTCTTTGCCCTCGGACG                                                                 。