[发明专利]应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法在审
| 申请号： | 201910303834.2 | 申请日： | 2019-04-16 |
| 公开（公告）号： | CN110004216A | 公开（公告）日： | 2019-07-12 |
| 发明（设计）人： | 张建城;徐坤;于佳平 | 申请（专利权）人： | 艾美汉信疫苗（大连）有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 大连非凡专利事务所 21220 | 代理人： | 闪红霞 |
| 地址： | 116600 辽宁*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | 本发明公开一种应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法，将构建完成的重组汉逊酵母阳性克隆株接种至液体培养基中，培养至对数期加入甲醇进行诱导表达，从加入甲醇进行诱导表达开始，直至发酵终点，定时对培养物进行采样并提取样品总RNA；使用一步法荧光实时定量PCR对所提取样品的总RNA进行反转录和扩增汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因；获得各样品汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因的扩增循环数，计算每个采样时间点的相对表达增量K（%），按照采样时间和K(%)值关系建立折线图即可。 | ||
| 搜索关键词： | 汉逊酵母 实时定量PCR 甲醇氧化酶基因 肌动蛋白 结构基因 目的基因 应用荧光 诱导表达 总RNA 采样 甲醇 发酵 采样时间点 阳性克隆株 液体培养基 发酵终点 关系建立 扩增循环 对数期 反转录 培养物 一步法 检测 构建 扩增 荧光 接种 | ||
【主权项】：
1.一种应用荧光实时定量PCR检测重组汉逊酵母发酵表达速率的方法，其特征在于按照如下步骤进行：a. 将构建完成的重组汉逊酵母阳性克隆株接种至液体培养基中，培养至对数期加入甲醇进行诱导表达，从加入甲醇进行诱导表达开始，直至发酵终点，定时对培养物进行采样并提取样品总RNA；b. 使用一步法荧光实时定量PCR对所提取样品的总RNA进行反转录和特异性扩增，所述特异性扩增是扩增汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因；c. 获得各样品汉逊酵母肌动蛋白结构基因、甲醇氧化酶基因及目的基因的扩增循环数，分别记为![]()
、![]()
及![]()
；d. 按下式计算每个采样时间点的相对表达增量K（%）：![]()
； e. 按照采样时间和K(%)值关系建立折线图，得到目的基因在重组汉逊酵母中诱导后随时间的表达速率。
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