[发明专利]一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法

摘要

本发明公开了一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法，该方法包括选择一个可诱导的穿梭质粒，将CRISPRi‑dCas9基因插入到穿梭质粒中，依据铜绿假单胞菌的必需基因和非必需基因，设计相应的sgRNA表达序列，最后将sgRNA表达序列插入至上述重组质粒中即得CRISPRi系统。

主权项

1.一种铜绿假单胞菌CRISPRi系统的构建方法，包括以下步骤：1)选择并酶切可诱导的穿梭质粒PHERDB20，通过酶切连接法将dCas9基因插入至PHERDB20穿梭质粒中的阿拉伯糖启动子下游，构建PHERDB20‑dCas9重组质粒；2)依据文献报道铜绿假单胞菌的必需基因和/或非必需基因，基于特德原则，为每条基因选取合适的sgRNA序列，通过吉布森克隆法插入步骤1)的PHERDB20‑dCas9重组质粒中，构建PHERDB20‑dCas9‑sgRNA重组质粒，或者以启动子+20nt靶序列+handle结构+终止子直接合成sgRNA的表达序列，通过酶切‑连接法，构建PHERDB20‑dCas9‑sgRNA重组质粒，完成CRISPRi系统的构建；3)选取不同的必需基因，对构建的CRISPRi系统进行验证，任选的4)基于构建的CRISPRi系统筛选潜在的抗生素作用靶点。