[发明专利]一种高效的一步组装多个基因片段的方法

摘要

本发明公开了一种高效的一步组装多个基因片段的方法，包括overlap PCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤为：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR，先通过特异性引物的overlap PCR获得较纯的大片段PCR，再通过Gibson组装到目标载体，获得基因全长。本发明相较常规的PCR拼接，PCR产物特异性更强，产量更高，更适合做后续的Gibson组装应用该方法可大大缩短3k‑8k的大基因合成的时间，只需要一轮时间，并且该方法很稳定，适合于大规模基因合成和自动化。

主权项

1.一种高效的一步组装多个基因片段的方法，其特征在于，包括overlap PCR—Gibson同源重组步骤，具体步骤如下：步骤(1)overlap PCR：第一轮PCR：分别用引物对upper1和lower1、upper2和lower2对目标待融合片段进行PCR扩增，分别将两种产物回收，得到A和B片段；第二轮PCR：用片段A和片段B作为模板，将片段A和片段B等摩尔数加入，总量不超过100ng，引物只加入upper1和lower2，其他组分不变，首先设置温度梯度摸索合适的退火温度，然后用合适的退火温度进行PCR扩增，电泳观察后测序检测序列是否正确，获得纯的大片段PCR；步骤(2)Gibson同源重组：通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，这部分对应的退火温度高于48摄氏度，将一个目的基因构建到表达载体上，同时在这个目的蛋白的N端融合上一个大的融合标签，帮助蛋白表达/检测/纯化；将设计引物扩增出这两个DNA片段，同时这两个DNA片段有各有一部分是同源的，同时这两个DNA片段与载体上各有一部分是同源的；然后，两个DNA片段进行克隆之后，再进行DNA纯化，最后将线性化的载体片段，这两个DNA片段和Gibson assembly master mix孵育一个小时后直接转化感受态细胞，实现将PCR组装到目标载体。