[发明专利]一种猪圆环病毒3型感染性克隆的构建及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种猪圆环病毒3型（PCV3）感染性克隆的构建方法及鉴定方法，构建时利用圆环病毒本身的特性，即PCV3的核酸为环状DNA，任何位置都可以看做是起始位点也可以看做是终点的特征，首先对PCV3的DNA序列进行重排，再对其进行改造。以往的研究仅是根据临床组织进行PCV3病毒的鉴定，对于检测病原的Western blot鉴定标准一直未见报道。因此，本发明在制备PCV3 Cap单克隆抗体的基础上，再进行感染性克隆的构建及鉴定。本发明方法不利用外源质粒获得PCV3感染性克隆，从而排除外源基因的感染；设计独特的检测引物，该引物仅能对环状PCV3 DNA进行PCR检测，对于成环前的PCV3 DNA不能进行PCR检测。PCR检测使用了PCV3的特异性单克隆抗体对其进行检测，实验数据更加可信。

主权项

1.一种猪圆环病毒3型感染性克隆的构建方法，其特征在于：其步骤包括：（1）将NCBI公布的猪圆环病毒3型线性DNA序列在snapgen软件上的成环；（2）对猪圆环病毒3型成环后DNA独立酶切位点的筛选，筛选具有单一酶切位点的位置进行开环；（3）对开环后的猪圆环病毒3型 DNA序列进行改造，在开环后的线性DNA序列末端添加酶切位点，得到重排后的线性猪圆环病毒3型 DNA序列，具体DNA序列如下：aagcttgtgc ggatgcggct gcgcgggaat tgcagttgta tttcaagcca cgggggcctt    60ggtgggatgg ttataatggg gagggtgctg ttattctgga tgatttttat gggtgggttc    120catttgatga attgctgaga attggggaca ggtaccctct gagggttcct gttaagggtg    180ggtttgttaa ttttgtggct aaggtattat atattactag taatgttgta ccggaggagt    240ggtattcatc ggagaatatt cgtggaaagt tggaggcctt gtttaggagg ttcaccaagg    300ttgtttgttg gggggagggg ggggtaaaga aagacatgga gacagtgtat ccaataaact    360attgatttta tttgcacttg tgtacaatta ttgcgttggg gtgggggtat ttattgggtg    420ggtgggtggg cagcccccta gccacggctt gtcgccccca ccgaagcatg tgggggatgg    480ggtccccaca tgcgagggcg tttacctgtg cccgcacccg aagcgcagcg ggagcgcgcg    540cgaggggaca cggcttgtcg ccaccggagg ggtcagattt atatttattt tcacttagag    600aacggacttg taacgaatcc aaacttcttt ggtgccgtag aagtctgtca ttccagtttt    660ttccgggaca taaatgctcc aaagcagtgc tccccattga acggtggggt catatgtgtt    720gagccatggg gtgggtctgg agaaaaagaa gaggctttgt cctgggtgag cgctggtagt    780tcccgccaga attggtttgg gggtgaagta acggctgtgt ttttttttag aagtcataac    840tttacgagtg gaactttccg cataagggtc gtcttggagc caagtgtttg tggtccaggc    900gccgtctaga tctatggctg tgtgcccgaa catagttttt gtttgctgag ccggagaaat    960tacagggctg agtgtaactt tcatctttag tatcttataa tattcaaagc taatggcagt    1020ttcccattcg tttaggcggg taatgaagtg gttggcgtgc cagggcttgt tattctgagg    1080ggttccaacg gaaatgacgt tcatggtgga gtatttcttt gtgtagtatg tgccagctgt    1140gggcctccta atgaatagtt ttcttctgac atagcgcctt ctgtggcgtc gtcgcctcct    1200tgggcggggt cttcttctga atatagctct gtgtctcatt ttggtgccgg gctagtatta    1260cccggcacct cggaacccgg atccacggag gtctgtaggg agaaaaagtg gtatcccatt    1320atggatgctc cgcaccgtgt gagtggatat accgggcagt ggatgatgaa gcggcctcgt    1380gttttgatgc cgcaggacgg ggactggata actgagtttt tgtggtgcta cgagtgtcct    1440gaagataagg acttttattg tcatcctatt ctaggtccgg agggaaagcc cgaaacacag    1500gtggtgtttt acgataaaca actggacccc gaccgagtgg gaatctattg tggagtgtgg    1560aggcagtata gcgagatacc ttattatcgg caaagaggtt ggaaaaagcg gtaccccaca    1620cttgcaaggg tacgtgaatt tcaagaacaa aaggcgactc agctcggtga agcgcttacc    1680cggatttggt cgggcccatc tggagccggc gagggggagc cacaaagagg ccagcgagta    1740ttgcaagaaa gagggggatt acctcgagat tggcgaagat tcctcttcgg gtaccagatc    1800ggatcttcaa gcagcagctc ggattctgac ggagacggcg ggaaatctga ctgaagttgc    1860ggagaagatg cctgcagtat ttatacgcta tgggcggggt ttgcgtgatt tttgcggggt    1920gatggggttg ggtaaaccgc gtgattttaa aactgaagtt tatgttttta ttggtcctcc    1980aggttgtggg aaaacgcggg aagctt                                        2006；（4）通过分子生物学实验技术，对重排后的线性猪圆环病毒3型 DNA序列进行PCR扩增、纯化、酶切、纯化、连接、再纯化后构建完成。