[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法

摘要

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括：巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/5‑1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；硅胶柱层析；凝胶柱层析；再次硅胶柱层析；硅胶减压柱层析得到芥酸酰胺。本发明底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得。

主权项

1.一种利用巨大芽孢杆菌分离提取芥酸酰胺的方法，包括以下步骤：（1）粗提物的制备巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/5‑1/10后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；（2）硅胶柱层析将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40～80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，水浴挥干乙酸乙酯后上样在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚,石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇等比例洗脱，流速为10~20 mL/min，通过薄层层析色谱分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；（3）凝胶柱层析浓缩液对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%~85%的浓缩液，用体积比为1:1氯仿与甲醇溶液溶解后进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，并用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；（4）再次硅胶柱层析将浓缩组分再次进行硅胶层析，用氯仿:甲醇=30:1、20:1,100%甲醇进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；（5）硅胶减压柱层析将步骤（4）中目标粗品进行硅胶减压柱洗脱，用洗脱梯度为氯仿:甲醇=30:1,20:1、100%甲醇对样品进行洗脱，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩、干燥得白色粉末，即为芥酸酰胺。