[发明专利]一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法

摘要

本发明属于环境监测技术领域，涉及一种基于表面钝化和共价偶联的土霉素荧光检测方法。二维MOF纳米片表面与DNA的共价偶联有效地利用MOF纳米片表面有限的吸附位点，增强纳米片吸附DNA分子的能力，降低背景荧光信号。同时，采用短链DNA分子作为信号报告分子有效地提高荧光恢复效率，而反应体系中表面钝化剂聚苯乙烯磺酸钠的加入进一步削弱了纳米片对信号报告分子的吸附能力，使MOF纳米片传感器提高了对低浓度OTC的线性响应，增强了对OTC的检测性能。本发明的检测方法可以有效地降低荧光背景值，提高目标物诱导的信号响应值，有效地提升基于物理吸附原理构建的荧光传感平台对土霉素的检测性能。

主权项

1.一种基于表面钝化和DNA共价偶联修饰金属有机骨架纳米片的土霉素荧光检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)金属有机骨架纳米片的制备：按照质量比为17:100配制氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液，搅拌5‑10min后，逐滴缓慢加入氢氧化钠，再搅拌5‑10min后，逐滴缓慢加入抗坏血酸，其中，氯化铜、氢氧化钠与抗坏血酸三者的摩尔比4:2:1，继续搅拌5‑10min，此时得到的产物为黄色的立方氧化亚铜纳米颗粒；随后，通过离心分离收集固体，用乙醇清洗清洗3‑5次后，将固体再次分散到乙醇中，得到Cu₂O乙醇分散液；先配制H₃BTC的乙醇溶液，再配制PVP和均苯三甲酸的水溶液，混合搅拌5‑10min后，加入Cu₂O乙醇分散液，其中Cu、PVP和均苯三甲酸三者的质量比为64:4000:2000，1‑2min内混合液变为透明颜色；继续搅拌2‑5h后，混合液变为淡蓝色浑浊的分散液，说明形成金属有机骨架纳米片，混合液继续在室温下搅拌12‑24h后，通过离心分离收集固体产物，然后分别依次用乙醇和高纯水离心清洗3‑5次；将收集的固体粉末在25‑50℃下真空干燥12‑24h，得到浅蓝色粉末即为金属有机骨架纳米片，置于干燥条件下保存；(2)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的合成：取序列1氨基修饰的OTC适配体与等物质的量的序列2FAM标记的短链ssDNA在25‑35℃下混合均匀，放入水浴锅中，加热至90‑95℃，并保持5‑10min，形成部分杂交的双链DNA探针；将金属有机骨架纳米片分散在MES缓冲溶液中，并加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N‑羟基琥珀酰亚胺NHS，其中金属有机骨架纳米片、EDC和NHS三者的最终质量比25:10:10，MES缓冲溶液的浓度为10‑25mM，pH＝5‑6；上述混合体系在25‑35℃下磁力搅拌10‑30min后，加入部分杂交的双链DNA探针，其中，双链DNA探针的摩尔量与金属有机骨架纳米片的质量比为1mol:10⁶g，混合物在25‑35℃下搅拌12‑24h后，用高纯水离心清洗清洗2‑3次，收集固体产物，冷冻干燥12‑24h得到DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片；(3)DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片的表面钝化：将步骤(2)制备的DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片分散在HEPES溶液中，再加入PSS，混合液在25‑35℃下孵化1‑2h；其中，HEPES溶液的浓度为10‑25mM，pH＝7‑8；PSS在体系中的终质量浓度0.001％‑0.5％wt；(4)土霉素的定量检测：向步骤(3)制备的基于表面钝化和DNA共价偶联修饰的金属有机骨架纳米片中，缓慢加入0‑25μg/L的土霉素的HEPES溶液；在25‑35℃下，孵化0.5‑2h，测定反应体系荧光强度；其中，HEPES溶液的浓度为10‑25mM，pH＝7‑8；所述的DNA序列如下：序列1：5'‑NH₂‑C6‑CGT ACG GAA TTC GCT AGC CGA GGC ACA GTC GCT GGT GCC TAC CTG GTT GCC GTT GTG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G‑3'序列2：5'‑FAM‑CAC GTG GAG CTC GG‑3'。