[发明专利]一种表达人促卵泡生长激素（FSH）的方法

摘要

本发明公开了一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法。本发明将人促卵泡生长激素目的基因克隆到腺病毒载体，包装得到的重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞可以高效表达得到具备体外生物活性的重组人促卵泡生长激素蛋白。本发明提供了一种利用重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞制备重组人促卵泡生长激素的方法，该方法利用动物泌乳功能的乳腺上皮细胞制备了可分泌到细胞外且具备体外生物活性的重组人促卵泡生长激素蛋白，为动物乳腺上皮细胞用于制备重组人促卵泡生长激素蛋白可提供了可靠的方法，对将来利用转基因羊、牛等大动物乳腺生产重组人促卵泡搜生长激素提供可靠的技术依据。

主权项

1.一种表达人促卵泡生长激素(FSH)的方法，其特征在于，该方法是利用腺病毒载体在动物乳腺上皮细胞表达人促卵泡生长激素，包括以下步骤：(1)构建重组人促卵泡生长激素腺病毒载体以pAdTrack‑CMV为腺病毒穿梭载体，将人促卵泡生长激素基因克隆到pAdTrack‑CMV载体构建pAdTrack‑CMV‑FSH腺病毒穿梭载体，腺病毒穿梭载体pAdTrack‑CMV‑FSH与骨架载体pAdEasy‑1通过转化到大肠杆菌体内重组后获得了重组腺病毒载体pAdEasy‑FSH；(2)重组人促卵泡生长激素腺病毒的包装、扩增将重组腺病毒载体pAdEasy‑FSH转染到人胚胎肾细胞中，10‑14d后得到第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，收集第一代重组人促卵泡生长激素腺病毒，通过感染人胚胎肾细胞后继续扩增得到滴度更高的腺病毒，收集得到第三代重组人促卵泡生长激素腺病毒，测定第三代重组人促卵泡生长激素病毒的滴度；(3)重组人促卵泡生长激素腺病毒感染动物乳腺上皮细胞将重组人促卵泡生长激素腺病毒加入到培养了24‑30h的动物乳腺上皮细胞中，24h‑48h后收集动物乳腺上皮细胞蛋白；(4)重组人促卵泡生长激素的鉴定及纯化收集动物乳腺上皮细胞蛋白，通过蛋白质免疫印迹法(Western blotting)鉴定目的蛋白的表达，利用亲合层析方法纯化动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素；(5)重组人促卵泡生长激素活性检测将动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素进行体外活性检测，验证动物乳腺上皮细胞表达的重组人促卵泡生长激素具备体外生物活性。