[发明专利]Na+-H+交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法

摘要

本发明公开了Na⁺‑H⁺交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，包括如下步骤：准备药物与试剂；细胞培养及实验分组；MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪（EIPA）和顺铂(DDP)对细胞A2780/Taxol的IC₅₀；Hoechst 33258染色检测细胞调亡；Quantative Real‑time PCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量；Western blot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP‑1的表达量；细胞内Rh123的积累；统计学分析。本发明在卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol中，EIPA诱导的细胞酸化抑制了PIK3/Akt信号通路的作用，进而降低MRP‑1的表达及其向外转运药物的作用，能够增加抗肿瘤药物在卵巢癌细胞内的积累，提高化疗药物的疗效。

主权项

1.Na⁺‑H⁺交换泵抑制剂联合顺铂促卵巢癌耐药细胞凋亡的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：准备药物与试剂材料为：乙基异丙基氨氯吡咪（EIPA）、顺铂(DDP)、紫杉醇(Taxol)、卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol、反转录酶试剂盒、荧光染料SYBR Green real‑timePCR反应液、Rh123、Trizol 、Q‑PCR引物、兔抗人β‑actin、MDR‑1抗体、兔抗人PI3K、Akt‑1抗体、优质胎牛血清、 Annexin‑V細胞凋亡试剂盒、RMP11640培养基；S2：细胞培养及实验分组卵巢癌耐紫杉醇细胞A2780/Taxol培养于含800ng/mlTaxol、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37C、5%CO2培养箱中孵育，实验分4组：空白对照组、顺铂组、乙基异丙基氨氯吡咪组、乙基异丙基氨氯吡咪联合顺铂组；S3：MTT法检测乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC₅₀取对数生长期的细胞A2780/Taxol，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，RPMI1640培养基调整细胞密度为5x10⁵个/m1，接种至96孔细胞培养板中，每孔加100μ1细胞悬液，每个组设6个复孔，培养板放入CO₂培养箱中孵育，细胞贴壁后加入乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂 ，24小时和48小时分别取出培养板，每孔加入MTT溶液20μl，放入37摄氏度培养中4小时，吸去孔中液体，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm波长检测OD值，计算乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂对细胞A2780/Taxol的IC₅₀；S4：Hoechst 33258染色检测细胞调亡将灭菌的盖玻片置于6孔板中，接种A2780/Taxol细胞悬液，5x10个/孔，37℃培养箱培养24 h，实验组分别加入IC₅₀浓度的乙基异丙基氨氯吡咪和顺铂，继续培养24 h、36h、48h，除去培养液，用PBS清洗细胞3次，每孔加入1ml的Hoechst 33258染色液，室温放置3‑5分钟，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗涤2‑3次，每次3‑5分钟，封片后荧光显微镜下观察拍照；S5：Quantative Real‑time PCR法检测A2780/Taxol细胞中目的基因的含量Trizol法提取各组总RNA，酶标仪检测OD260/0D280在1.8‑2.0之间的，表明RNA纯度好，按逆转录试剂盒要求合成cDNA，将合成的cDNA稀释后，冰上配置20μl的PCR反应体系，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95C30s预变性，然后95C5s，60C35s，共35个循环，实验重复3次，以B‑actin为内参基因，用2^‑△△ct法计算各基因mRNA的相对表达量；S6：Western blot法检测PI3K、Akt蛋白及MRP‑1的表达量参照SDS‑聚丙烯酰胺快速凝胶试剂盒说明制备5%的浓缩胶及10%的分离胶，调整各组蛋白样品上样量20μg，按照浓缩胶60V，分离胶100V的电压将蛋白质进行垂直凝胶电泳后，半干法转移至NC膜，洗膜后，快速封闭液封闭15 分钟，分别加入稀释的PI3K、Akt及MRP‑1的兔抗人抗体，4C孵育过夜，洗涤3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1.5小时，再次洗涤3次，每次3分钟，超敏化学发光试剂盒检测信号，内参为β‑actin，以目的蛋白条带的灰度值/内参条带的灰度值表示目的蛋白的相对表达量；S7：细胞内Rh123的积累取对数生长期的A2780/Taxol细胞，实验分组同上，继续培养24h小时，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后，在含有5μM Rh123的RMPI1640培养基中37C孵育60分钟，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，流式细胞仪激发波长488nm、发射波长530nm检测细胞内细胞内平均荧光强度，以此观察细胞内Rh123的的含量；S8：统计学分析采用SPSS16.0统计软件包，对数据进行检验，所有数据均采用mean+SD方式表示，用单因素方差分析检验总体均数差异性，有显著性差异者再进行两两比较，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异极显著性。