[发明专利]一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心-酶联免疫吸附试剂盒

摘要

本发明提供一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶双抗夹心‑酶联免疫吸附试剂盒，包括预包被H5N8神经氨酸酶特异性单克隆抗体的96孔酶标板、阳性品、阴性品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；将H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因片段克隆、重组表达、纯化复性后获得神经氨酸酶N8蛋白免疫抗原，利用生物信息学软件预测H5N8亚型禽流感病毒的神经氨酸酶抗原表位，人工合成相应多肽后将其预包被至酶标板，采用多肽‑酶联免疫吸附(ELISA)模式，筛选杂交瘤中的神经氨酸酶特异性抗体，多肽‑ELISA检测体系获得稳定的多个位点杂交瘤细胞株及单抗，构建双抗夹心N8蛋白‑ELISA检测体系检测试剂盒。

主权项

1.一种检测H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶的双抗夹心‑酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：以H5N8亚型禽流感病毒神经氨酸酶N8重组蛋白为免疫原，表位多肽1‑KIITIGSISLGLVVFNVLLHAVSIILTVLAL、2‑DSKAVAVVHYGGVPTDVVN、3‑NRPVLVISPDLSYRIGYLCAGLPS、4‑GSFTLPVELSGRECLVPCFWV为筛选抗原，获得各表位特异性单克隆抗体，筛选配对夹心抗体对；包括预包被特异性抗原表位1单抗的96孔酶标板、N8阳性样品、阴性对照、辣根过氧化物酶标记抗原表位4抗体、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所特异性抗原表位1单抗，用包被液稀释浓度至5微克/毫升后包被于96孔酶标板，100微升/孔，4℃反应过夜后洗板3次；每孔加入200微升含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，37℃孵育2小时后洗板3次，晾干，即为试剂盒中预包被抗体的酶标板；取待测样品加入包被孔，分别以N8重组蛋白作为阳性对照、阴性血清作为阴性对照，37℃孵育1小时后洗板5次；每孔加入100微升1：5000稀释的HRP‑特异性抗原表位4 IgG，37℃孵育1小时，洗板5次；每孔加入100微升显色液，37℃暗反应15分钟；每孔加入50微升终止液，震荡混匀，用酶标仪测定492纳米的吸光度值，以阴性对照孔的平均吸光度值的2.1倍为阈值判定阴阳性。