[发明专利]一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法

摘要

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。其包括间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，该方法不仅可提高外泌体产量，而且所得到的外泌体具有纯度高、粒径适当等特点。该方法操作简单、成本低，适合大量提取外泌体，有利于临床应用，对应用间充质干细胞外泌体治疗临床疾病有重大意义。

主权项

1.一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法，其特征在于：包括间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，其具体步骤如下：步骤一：脐带间充质干细胞培养基配比如下：100ml DMEM/F12培养基+2ml非必须氨基酸+2ml L‑谷氨酰胺+2ug VCAM1试剂；步骤二：从低温容器中取出间充质干细胞(MSC)，迅速置于37℃水浴中连续晃动，1分钟内快速解冻；步骤三：无菌条件下，将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml细胞培养基的离心管中；1500rpm离心5分钟，吸弃离心后上清；步骤四：加入适量的新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数及活率检测；步骤五：根据细胞数量及活率，用培养基调整细胞接种密度为1.0×105个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养器皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；在培养器皿上做好标记，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养；步骤六：观察细胞状态，隔天换液；当细胞汇合度达到80‑90％时，可进行传代处理；步骤七：在4℃下进行外泌体分离：48小时后提取细胞上清离心，分别应用1500rpm离心5分钟，2000g离心10分钟，10000g离心20分钟；步骤八：最后，通过Beckman Coulter超速离心机Type 70Ti转子以100000g超速离心120分钟来分离外泌体。收集沉淀的外泌体，并重悬于无菌PBS中；步骤九：随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化外泌体。将外泌体储存在‑80℃。