[发明专利]中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法

摘要

本发明公开了一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，涉及中药材生物活性检测技术领域，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验，在中医药中，藏青果和诃子是两种不同的中药，二者均来源于使君子科植物诃子，藏青果是未成熟果实，诃子是成熟果实，筛选结果表明，诃子和藏青果均具有抗甲型流感病毒的活性，诃子酸和诃黎勒酸能够通过抑制病毒神经氨酸酶介导的后代病毒粒子的释放从而抑制甲型流感病毒的释放，且药效效力几乎不受替代作用的影响，是对抗流感病毒的很好的抗病毒候选者，从而对中药中的抗病毒药物品类进行了补充，增加医生和病患对抗流感病毒中药的选择使用。

主权项

1.一种中药诃子和西青果抗流感活性的筛选方法，包括高通量筛选、病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验和病毒滴度降低实验，其特征在于：所述高通量筛选过程为：用带有报告基因的重组流感PR8‑PB2‑Gluc对352种中药水提物进行高通量筛选，白色96孔板每孔铺104个细胞，24小时后，用重组流感病毒PR8‑PB2‑Gluc以moi＝0.01感染细胞，同时用中药进行干预，设置健康对照组和流感阴性对照组，孵育36小时后，用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性，筛选出抑制率>90％的中药，筛选出的单体从100uM开始，3倍稀释，做8个稀释度，利用GraphPad Prism软件，通过拟合剂量依赖性曲线得出单体的IC50和CC50；所述病毒释放抑制实验过程为：为了确定中药和其已知成分是否可以抑制后代病毒粒子的释放，PR8‑PB2‑Gluc病毒以MOI＝0.1感染MDCK细胞，12小时后，吸弃掉原有培养液，PBS洗3遍，换为新鲜的含有不同浓度药物和2ug/mL TPCK‑trypsin的Opti‑MEM，孵育2小时后，收集上清液，并检测上清液中的荧光素酶活性；所述神经氨酸酶抑制实验过程为：在不同浓度的待测中药或单体的存在下，将神经氨酸酶和神经氨酸酶底物孵育，1小时后，检测荧光信号的强度，激发波长为322nm，发射波长为450nm，荧光信号的下降程度即表示神经氨酸酶抑制效果；所述病毒滴度降低实验过程为：将MDCK细胞铺于24孔板中，用耐达菲株甲型流感病毒/H1N1pdm(09)以MOI＝0.01感染，用不同浓度的待测药物进行干预，36小时后，收集上清液，用MDCK细胞检测上清液中的病毒滴度(TCID50/mL)。