[发明专利]一种3D DNA行走机器耦合催化发夹自组装的microRNA生物传感器

摘要

在本专利中，我们提出了一种新的、熵驱动的三维DNA步行机器，它结合了催化发夹组装反应(CHA)成功的用于检测microRNA。此步行机器使用了链霉亲合素包裹的聚苯乙烯微球作为3‑D轨道基质，以保证良好的重复性。其制备方法是将miRNA‑21作为一个靶目标，通过熵驱动链置换反应不断地在DNA功能化的聚苯乙烯微球轨道上行走，导致聚苯乙烯微球上DNA三核酸复合底物的分解，从而实现miRNA 21的循环。此外，从DNA三核酸复合底物中释放大量辅助链可以催化CHA反应并伴随着获得荧光信号的增加。这种复合生物传感器的线性范围在50pM‑20nM之间，检测限低至41pM。此外，在重复性试验(1.05％至4.22％)和回收率试验(99.5％至104.8％)中均获得了满意的结果。结果表明，该方法在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

主权项

1.一种简便的、熵驱动的3-D DNA行走机器耦合催化发夹自组装反应用于microRNA检测的生物传感器，其制备方法包括以下步骤：/n(1)、3-D DNA行走机器的制备/n将纯化后的三条核酸链LS、AS、S和TEMg缓冲液经退火后重新折叠以制备LS/AS/S三核酸复合物(C3)。LS∶AS∶S的比值为1∶1.5∶1.5。退火过程是将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。接着将链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球(PS)50μL以12000转离心5分钟，用binding buffer洗涤2次后离心弃去上清液。再用50μL binding buffer重悬浮后加入5μLμM C3。在37℃恒温箱孵育15分钟后，用TEMg缓冲液洗涤3次，12000转离心5分钟弃去上清。最后再用50μL的TEMg缓冲液重悬浮，最后DNA功能化的3-D DNA行走机器(C3/PS)制备完成。/n(2)、信号探针的制备/n将发夹探针(H1)和发夹探针(H2)退火后重新折叠。将溶液在PCR仪里加热到95℃，5min，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度慢慢降低到25℃。将标记了FAM的信号探针RepF，标记了BHQ1的信号探针RepQ以1∶2的比例在1×TNaK缓冲液中杂交。/n(3)、MicroRNA的检测/n将5μL C3/PS复合物，2μL 10μM燃料核酸(FS)，33μL cutsmart缓冲液，和10μL不同浓度的目标物在37℃恒温箱孵育60分钟。然后离心分离取40μL的上层清液添加到含有5μL 1μMH1，2μL 10μM H2，10μL 50nM RepF：RepQ复合物和23μL 1×TNaK缓冲液中，在室温下避光反应60分钟。最后用荧光分光光度计测量荧光信号。/n