[发明专利]一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法，属于细胞生物学技术领域。本发明使用的OpTmizer细胞培养基中加入低浓度的猴自体血清，T细胞培养必备的IL‑2，以及已报道能够促进γδT细胞扩增的IL‑18等物质，能较快且稳定地在体外培养出高纯度的γδT细胞，培养的细胞具有典型的γδT细胞形态特征和免疫学特性，此外，该方法采用猴自体血清培养细胞，降低外源性血清对实验结果的干扰、步骤少，适合于需使用中国恒河猴γδT细胞的科研工作。

主权项

1.一种中国恒河猴γδT细胞的培养方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）分离中国恒河猴外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）；（2）分化、诱导、培养猴γδT细胞：步骤（1）的PBMCs用PBS重悬、洗涤2次，洗过的细胞经离心回收，每次400g离心10 min，最后用专用培养液重悬PBMCs，重悬的细胞密度为2×10⁶个细胞/mL，立即加入到48孔培养板，以3×10⁶个细胞/孔密度进行培养；每隔2‑3天，弃去孔中一半体积的旧培养液，并添加新鲜的含中国恒河猴自体血清的OpTmizer细胞培养液，保持细胞浓度在0.5~2×10⁶个细胞/mL，最后将细胞悬液转移到培养板或细胞培养瓶中进行培养；所述专用培养液的组成为：含有5%中国恒河猴自体血清、1%浓度为10⁴ U/mL青霉素‑10⁴ μg/mL链霉素、1‰的浓度为10mol/L的4‑（2‑羟乙基）‑1‑哌嗪乙磺酸（HEPES）、5μmol/L的唑来膦酸、1000U/mL的重组人白介素‑2（IL‑2），以及10ng/mL的猴白介素‑18（rIL‑18）的OpTmizer细胞培养基；所述含恒河猴血清的OpTmizer细胞培养液为：含2%中国恒河猴自体血清、1%青霉素‑链霉素、1‰的HEPES、1000 U/mL IL‑2以及10ng/mL rIL‑18的OpTmizer细胞培养液；（3）培养细胞鉴定：猴细胞形态学观察、用流式细胞仪检测细胞表面CD3及TCR Vγ9表达水平、免疫激活表型以及猴γδT细胞分泌的IFN‑γ的表达水平。