[发明专利]一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法

摘要

本发明公开一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法。该方法包括Foc1分生孢子悬浮液的制备、Foc1菌丝体的收集、菌丝体细胞壁的酶解、Foc1原生质体的收集、Foc1原生质体的再生等步骤。本发明通过所述方法酶解菌丝细胞，所获原生质体的制备数最高达到6.0×108个/mL，所得原生质体大小均一，形态饱满，近似圆形。本发明采用含有200g/L葡萄糖的CM固体培养基作为再生培养基，提高了Foc1原生质体的再生率，最高为28.6％，明显高于现有的香蕉枯萎病菌原生质体的再生方法，为后续原生质体转化技术研究香蕉病菌致病分子机制提供了良好的基础。本发明方法制备过程简单、高效，便于操作。

主权项

1.一种香蕉枯萎病菌1号小种原生质体的制备与再生方法，其特征在于包括如下步骤：(1)Foc1分生孢子悬浮液的制备：将Foc1接种于PDA培养基中培养；取菌丝块，加至查氏培养基中，震荡培养；将培养液用100～200目细胞筛过滤，离心，弃上清；用NCM培养基重悬沉淀并进行稀释，制得Foc1分生孢子悬浮液；(2)Foc1菌丝体的收集：将制备好的分生孢子悬浮液接种于NCM培养基中，使分生孢子终浓度为(1～5)×10⁶个/mL；于25～30℃下130～150rpm震荡培养11～12h，用100～200目细胞筛过滤，并用渗透压稳定剂冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体；所述的NCM培养基含有以下组分：葡萄糖10g/L、天冬氨酸4～8g/L、20×硝酸盐50mL/L、200×铁盐5mL/L、1000×维生素1mL/L、1000×微量元素1mL/L，用去离子水定容，pH值为6.2～6.5；所述的渗透压稳定剂为0.6～0.8mol/L NaCl溶液；(3)菌丝体细胞壁的酶解：取步骤(2)获得的新鲜菌丝体，按照每0.1g新鲜菌丝体添加1mL酶解液的比值加入酶解液；于30±0.5℃下120～150rpm的摇床中酶解3～4h，原生质体数量达到(2.0～6.0)×10⁸个/mL，得到原生质体酶解液；所述的酶解液为：10～15g/L溶壁酶、10～15g/L崩溃酶、溶剂为0.6～0.8mol/L NaCl溶液；或者，15～20g/L崩溃酶、溶剂为0.6～0.8mol/L NaCl溶液；配置好后用直径为0.22μm滤膜过滤除菌；(4)Foc1原生质体的收集：用3～5层无尘纸或擦镜纸过滤原生质体酶解液，离心，弃上清；加入预冷的STC溶液重悬沉淀；离心，弃上清；再加入预冷的STC溶液将沉淀重悬，得到Foc1原生质体悬液；所述的离心的条件均为于4℃、400～800g离心10～15min；(5)Foc1原生质体的再生：将Foc1原生质体悬液分别用STC溶液和无菌水稀释至(0.2～1)×10⁴个/mL；再取100～200μL原生质体稀释液与15mL CM高渗再生培养基混匀后倒平板，于25～30℃倒置培养，培养2～3d直至长出再生菌落；调查再生情况，计算再生率；再生率(％)＝(STC溶液稀释处理上长出的菌落数目‑无菌水稀释处理长出的菌落数目)×100/总原生质体数；所述的CM高渗再生培养基为：葡萄糖200g/L、蛋白胨2g/L、酵母提取物1g/L、酪蛋白水解物1g/L、20×硝酸盐50mL/L、1000×维生素1mL/L、1000×微量元素1mL/L，用去离子水定容，pH值为6.5。