[发明专利]CoQ10在抗矽肺纤维化中的应用

摘要

本发明公开了CoQ₁₀在抗矽肺纤维化中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)设置对照组：选取SPF级6周龄雄性C57小鼠24只，体重20±2g，先适应性饲养一周后随机分为对照组、模型组、治疗组；模型组、治疗组采用气管内一次性滴注0.1mL SiO₂悬液构建小鼠矽肺模型，对照组同法滴注等体积生理盐水；治疗组术后48h后每日给予0.1mL CoQ₁₀，灌胃，对照组、模型组自主进食。本发明具有如下优点：CoQ₁₀降低SiO₂诱导的矽肺纤维化，CoQ₁₀能够下调胶原蛋白、羟脯氨酸及α‑SMA表达，其作用机制可能是反馈性调节内源性HMGCR表达，影响氧化呼吸链，为后续矽肺治疗的机制的研究提供了新视角。

主权项

1.CoQ₁₀在抗矽肺纤维化中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)设置参照组：选取SPF级6周龄雄性C57小鼠24只，体重20±2g，先适应性饲养一周后随机分为对照组、模型组、治疗组；模型组、治疗组采用气管内一次性滴注0.1mL SiO₂悬液构建小鼠矽肺模型，对照组同法滴注等体积生理盐水；治疗组术后48h后每日给予0.1mL CoQ₁₀，灌胃，对照组、模型组自主进食；(2)制备矽肺模型：将小鼠异氟烷麻醉后，暴露气管，分别于对照组滴注0.1mL生理盐水、模型组和治疗组分别气管内滴注0.1mL SiO₂悬液，然后缝合皮肤，观察小鼠生存状态；治疗组术后48h，每只小鼠每日给予0.1mL CoQ₁₀灌胃；60天后，用0.3mL0.3％乌拉坦腹腔注射麻醉处死小鼠，取右肺中叶，再用生理盐水冲洗后用4％多聚甲醛固定，其余肺组织放入‑80℃冰箱冻存；(3)HE染色及天狼星红染色：当用4％多聚甲醛固定右肺中叶48h后，脱水，包埋，切片，切片厚度为8μm，在56℃条件下烤片6h后进行HE染色及天狼星红染色；(4)羟脯氨酸测定：用天平准确称取50mg冻存的小鼠肺组织，冰上剪碎，加入1mL水解液，在96℃条件下水浴，充分水解20min，流水冷却后，调节各管PH在6.0‑6.8，加双蒸水至10mL混匀，加入适量活性炭，在3500rpm条件下离心10min，取上清1mL做检测；分别设空白管，标准管及检测管，依次滴加一、二、三号试剂，混匀后在60℃条件下水浴15min，冷却后在3500rpm条件下离心10min，取200μL上清于96孔板，利用酶标仪在波长550nm处检测各管吸光度值，计算各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量，并进行统计分析；(5)实时荧光定量PCR反应：称取各组小鼠肺组织，冰上剪碎，加入RZ裂解液，匀浆处理，提取各组小鼠肺组织总mRNA，使用微量分光光度计测量样品总RNA的浓度及纯度；将提取的mRNA逆转录为cDNA，cDNA产物浓度为0.5μg/10μL体系，逆转录条件为37℃，15min，85℃，5s；再进行实时荧光定量PCR反应，检测各组小鼠肺组织α‑SMA，HMGCR在转录水平的表达差异，数据处理采用2^‑△△Ct对目的基因进行相对定量分析；(6)免疫组织化学：各组小鼠肺组织的石蜡切片用二甲苯脱蜡，2次每次10min，梯度酒精脱水：用100％酒精、2次每次5min，用95％酒精、85％酒精、75％酒精、50％酒精，各1次，5min；用枸橼酸钠(PH＝6)抗原热修复15min，再用山羊血清封闭10min，将α‑SMA/HMGCR一抗孵育过夜，HRP标记的山羊抗兔/抗鼠二抗孵育30min，DAB显色6min，苏木素染色20s，流水冲洗2min，脱水、透明、封片，普通光镜显微镜下10倍物镜取图，观察各组α‑SMA及HMGCR蛋白表达情况，以Image‑Pro Plus 6.0统计阳性区域，结果以阳性区域IOD值与图片面积的比值进行定量；(7)统计：采用SPSS 20.0软件统计学分析，各组数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析进行，组间两两比较采用LSD法，检验水准为α＝0.05。