[发明专利]一种LRFFT2细胞的构建方法

摘要

本发明提供一种LRFFT2细胞的构建方法，使用人源外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效多肽，通过精准有效多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的RFF细胞；再利用TCR－T技术原理进行了改造；改造后的T细胞在体外用抗体药物进行免疫抑制性信号的封闭，精准的保护了特异性杀伤T细胞免受体内抑制，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，得到更为攻防兼备的LRFFT2细胞。LRFFT2细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。

主权项

1.一种LRFFT2细胞的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧各延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，合成连接后的突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)使用所述慢病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；5)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，通过检测IFN‑γ的分泌，筛选出有效的精准多肽；6)以所述精准多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，对刺激后的细胞进行CD8、CD137、IFN‑γ的染色，并以流式细胞仪进行分选，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，测序并得到特异性细胞的高频TCR基因；7)利用CRISPR技术敲除外周血T细胞中原有的TCR基因，转入上步获得的能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，获得TCR‑T细胞；8)细胞表面免疫抑制性信号分子经抗体药物体外封闭，即得LRFFT2细胞。