[发明专利]一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法

摘要

本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，包括前期准备、PCR产物纯化且定量、对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制、样本中各菌种含量测定的步骤。本发明的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。

主权项

1.一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：具体步骤为：(1)前期准备：选取肠道内混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，其中孔道内获得物依次为：罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、细菌通用、细菌通用阴性对照、DNA Marker 2000；(2)PCR产物纯化且定量：对步骤(一)中获得孔道内菌株，进行PCR产物纯化且定量；(3)对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制：各菌株PCR产物10倍梯度稀释至10^‑8，取10^‑2‑10^‑8梯度作为标准曲线各梯度下模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，其中每个梯度设置三个重复周期，一个周期为：第一温度(90‑95)℃下(20‑30)s、第二温度(90‑95)℃下(5‑10)s、第三温度(60‑63)℃下(0.8‑1.5)min，设置第二、第三温度下循环30‑40次；(4)样本中各菌种含量测定：将样本中各菌种的Ct值与步骤(3)获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。