[发明专利]一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法

摘要

本发明公开了一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，包括：基于待测微生物DNA条码基因特点差异化设计NM‑PCR的通用引物和特异引物，NM‑PCR一步检测反应体系建立，即以待测微生物基因组DNA作为PCR反应模板进行参数优化，待测样本中微生物基因组快速DNA提取，以样本中基因组DNA作为模板进行NM‑PCR扩增反应，PCR反应产物进行凝胶电泳检测。本发明兼具巢式PCR的特异性和多重PCR的高通量，且仅需一步PCR反应完成上述两次PCR过程，避免传统PCR多步操作，可以快速大量检测临床样本如环境水源、食品的微生物污染情况，特异性强，通量高，大大缩短检测时间和成本。

主权项

1.一种整合多重巢式PCR一步检测多种微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)基于待测微生物DNA条码基因差异化设计NM‑PCR的通用引物和特异引物，进行PCR扩增反应；其中，以巢式PCR引物为通用引物，以多重PCR引物为特异引物；(2)提取步骤(1)中待测微生物标准株基因组DNA；(3)将步骤(2)中基因组DNA作为PCR模板，优化NM‑PCR参数并构建NM‑PCR一步检测反应体系；(4)将步骤(3)中NM‑PCR一步检测反应体系进行待测样本中微生物检测，包含待测微生物基因组DNA富集阶段和待测微生物特异区域扩增阶段；(5)将步骤(4)中所得PCR反应产物进行凝胶电泳检测，所得待测样本检测结果与待测细菌扩增片段理论值对照；其中：步骤(1)中，所述差异化设计NM‑PCR的通用引物和特异引物包括：在待测物种DNA条码基因位于两端的保守区域设计通用引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，且引物长度在26bp以上，个别差异位点兼并碱基，退火温度为63℃～66℃，待测物种DNA条码基因变异区域设计片段长度不等的特异引物且引物长度在20bp以内，GC含量均一，退火温度为53℃～56℃。