[发明专利]共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置

摘要

共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法与装置属于荧光颗粒超分辨显微测量领域，本发明的测量系统中双光斑光束向量测量单元首先确定输出光束的方向向量，该输出光束透射所有测量组成部分的姿态平面镜块，在已知姿态平面镜块条件下，通过折射定理，可得姿态平面镜块的偏摆和俯仰姿态角，回位补偿偏摆和俯仰姿态角，便实现了显微光路共光轴姿态，另外，因该输出光束入射进显微成像光路中，其放大后的平移量可由测量系统获得，而实际平移量可由双光斑光束向量测量单元获得，由此可确定测量系统的放大倍数，该具有共光轴度和放大倍数自校准功能的测量系统为保证荧光单颗粒示踪的测量准确性提供必要技术手段。

主权项

1.一种共光轴度和放大倍数可自校准的荧光颗粒示踪方法，其特征在于该方法步骤如下： （1）激光扩束器将光纤准直头出射的输出光束调节为一极细光束，并且使该输出光束不与任何元件发生光学作用，直接入射进双光斑光束向量测量单元中，通过该输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑，得到输出光束在双光斑光束向量测量单元所决定坐标系中的方向向量；（2）在显微光路纵向位移平台上纵向移动CCD水平位移台到达某纵向位置后，再在CCD水平位移台上水平位移CCD姿态调节架，使输出光束透射CCD姿态平面镜块，因为CCD姿态平面镜块的平面法线与的感光接收面法线平行，所以，如果输出光束与CCD姿态平面镜块的平面法线不平行，即如果输出光束与CCD的感光接收面不垂直，输出光束将发生平移变化，即输出光束在双光斑光束向量测量单元中两个光斑位置探测器上被检测得到的光斑发生平移变化Δ_CCD，在已知CCD姿态平面镜块厚度d_CCD条件下，根据光束经平面镜块透射后入射光束与出射光束的空间平移关系，可得输出光束与CCD姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_CCD与Δ_CCD的关系式为Δ_CCD = sin(θ_CCD – θ) ×( d_CCD/ cosθ)，其中，n_a和n分别为空气折射率和平面镜块折射率，θ为θ_CCD对应的折射角，再根据折射率公式sinθ_CCD×n_a = sinθ×n ，得关于sinθ_CCD一元三次方程2×d_CCD×Δ_CCD× n_a² ×sin³θ_CCD + sin²θ_CCD×(d²_CCD×n² ‑ n_a²×Δ²_CCD ‑ d²_CCD×n_a²) ‑ 2×d_CCD×θ_CCD× n² ×sinθ_CCD +Δ²_CCD× n² = 0，解此方程，并通过θ_CCD为锐角这一条件舍去不符合实际的方程解后从而得到θ_CCD值，根据θ_CCD值用CCD姿态调节架调节CCD姿态，回位产生的光斑平移量Δ_CCD，即使输出光束与CCD的感光接收面垂直；（3）在显微光路纵向位移平台上纵向移动柱面透镜水平位移台到达CCD下方某位置处，再在柱面透镜水平位移台上水平位移柱面透镜姿态调节架，使透射过CCD姿态平面镜块的输出光束透射柱面透镜姿态平面镜块，如果输出光束不与柱面透镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_柱面，根据折射率公式，在已知柱面透镜姿态平面镜块厚度d_柱面 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_柱面，d_CCD替换为d_柱面，θ_CCD替换为输出光束相对柱面透镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_柱面，然后对其求解θ_柱面 值，根据θ_柱面 值用柱面透镜姿态调节架调节柱面透镜姿态，回位光斑平移量Δ_柱面，使输出光束与柱面透镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与柱面透镜底部平面垂直；（4）在显微物镜水平位移台上水平平移显微物镜姿态调节架，使显微物镜处于柱面透镜下方，并使透射过柱面透镜姿态平面镜块的输出光束透射显微物镜姿态平面镜块，如果输出光束不与显微物镜姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_物镜，根据折射率公式，在已知显微物镜姿态平面镜块厚度d_物镜 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_物镜，d_CCD替换为d_物镜，θ_CCD替换为输出光束相对显微物镜姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_物镜，然后对其求解θ_物镜 值，根据θ_物镜值用显微物镜姿态调节架调节显微物镜姿态，回位产生的光斑平移量Δ_物镜，使输出光束与显微物镜姿态平面镜块垂直，即使输出光束与显微物镜的光轴平行；（5）通过六维精密位移台平移载物板，使其处于显微物镜下方，并使透射过显微物镜姿态平面镜块的输出光束透射载物板姿态平面镜块，如果输出光束不与载物板姿态平面镜块垂直，输出光束在双光斑光束向量测量单元中测量得到的光斑平移量为Δ_载物，根据折射率公式，在已知载物板姿态平面镜块厚度d_载物 条件下，将步骤（2）的一元三次方程中Δ_CCD替换为Δ_载物，d_CCD替换为d_载物，θ_CCD替换为输出光束相对载物板姿态平面镜块平面法线俯仰夹角或偏摆夹角θ_载物，然后对其求解θ_载物 值，根据θ_载物 值用六维精密位移台调节载物板姿态，回位产生的光斑平移量Δ_载物，使输出光束与载物板姿态平面镜块垂直，即使输出光束与载物板平面法线平行；（6）通过六维精密位移台使载物板姿态平面镜块绕其Y坐标轴偏摆微小角度α和绕其X坐标轴俯仰微小角度β，分别使输出光束产生方向向量不变的空间平移，输出光束在双光斑光束向量测量单元中分别可测量得到沿X坐标轴和Y坐标轴方向光斑平移量为Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}，输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束经载物板的光通孔、显微物镜和柱面透镜后，入射到CCD的感光接收面，因为通过上述（2）至（4）步骤后柱面透镜与显微物镜实现了显微成像共光轴，并且该光轴与CCD的感光接收面垂直，所以由CCD可以测得光斑平移量Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β}分别对应的平移放大值为Δ_{微小_α_放大}和Δ_{微小_β_放大}，所以可得所搭建的光学系统装置沿X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大} / Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大} /Δ_{微小_β}；（7）通过六维精密位移台回位载物板姿态平面镜块在步骤（6）中产生的偏摆微小角度α和俯仰微小角度β，使输出光束与载物板平面法线重新平行，通过激光扩束器将输出光束调节为光斑较大的光束，使之可容易实现荧光颗粒的荧光激发；（8）在载物板上平面光通孔位置放置含有荧光颗粒样品，并放置折光镜组使输出光束经双光斑光束向量测量单元反射分光后的透射光束侧方入射荧光颗粒样品，激发荧光颗粒发出荧光，输出光束不与显微物镜、柱面透镜和CCD发生光学作用，至此可在所搭建的光学系统装置上进行X坐标轴和Y坐标轴方向显微放大倍数分别为Δ_{微小_α_放大}/ Δ_{微小_α}和Δ_{微小_β_放大} /Δ_{微小_β}的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量；（9）柱面透镜和CCD可移动至显微光路纵向位移平台上不同的纵向位置，在显微物镜支架上固定的显微物镜也可为不同放大倍数，重复上述（1）至（8）步骤，便可实现不同放大倍数下的共光轴显微荧光颗粒轨迹测量。