[发明专利]一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞在审
| 申请号： | 201910482661.5 | 申请日： | 2019-06-04 |
| 公开（公告）号： | CN110283847A | 公开（公告）日： | 2019-09-27 |
| 发明（设计）人： | 权富生;董翔宸;张涌;葛陆星;康健;刘旭;谢晓刚 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;C12N15/113;C12N5/10;C12N15/877 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 李冉 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞，利用电穿孔的方法将靶向Rosa26基因的Cas9切割载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现将FAD3和FABP4基因同时定点插入到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞基因组中；通过Junction PCR筛选和验证获得了打靶阳性克隆细胞；以本发明定点插入外源基因的阳性细胞为供核细胞移入去核的牛成熟卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎，进一步将克隆胚胎移植到受体牛体内，可获得所期望的转基因牛。本发明为快速、高效研制优质转基因肉牛育种新材料提供了供核细胞和技术方法。 | ||
| 搜索关键词： | 胎儿成纤维细胞 定点整合 供核细胞 鲁西黄牛 重组细胞 成熟卵母细胞 阳性克隆细胞 转基因克隆 打靶载体 克隆胚胎 肉牛育种 外源基因 阳性细胞 转基因牛 电穿孔 共转染 基因组 受体牛 转基因 靶向 去核 移入 切割 胚胎 体内 验证 移植 基因 期望 | ||
【主权项】：
1.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体，其特征在于，包括Cas9切割载体和打靶载体；所述Cas9切割载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶点在牛基因组22号染色体Rosa26基因上；所述打靶载体包括用于同源重组的重组基因MRF‑FAD3‑P2A‑FABP4‑PolyA，以及作为同源左臂的sgRNA靶点上游序列和同源右臂的sgRNA靶点的下游序列；所述重组基因MRF‑FAD3‑P2A‑FABP4‑PolyA依次包括牛骨骼肌特异性启动子MRF、由P2A相连的FAD3基因CDS区和FABP4基因CDS区以及PolyA。
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