[发明专利]一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法。包括分离胎盘干细胞，包裹在基质胶中，加入类器官生长因子，放入细胞培养箱中培养等步骤。本发明克服了细胞系模型和原代细胞模型单一细胞类型、永生化或癌化特征、原代细胞无法长期培养和传代的缺点，用本发明技术手段培养3D猪源胎盘类器官可永久传代、冻存，本发明首次提出的3D猪胎盘类器官将对基础研究和应用型研究具有重要的价值。

主权项

1.一种猪源3D胎盘类器官模型的建立方法，其特征在于，其步骤如下：(1)分别配置两份3ml的等渗30％和等渗60％Percoll，并将二者按浓度由大到小逐层缓慢加入到15ml的无菌离心管内，同时取淋巴细胞分离液5ml加入到该15ml无菌离心管内；(2)将猪胎盘组织放在超净工作台上使用无菌抗生素生理盐水反复冲洗8～10次，然后使用眼科剪子剪下猪胎盘绒毛并剪碎成多段；(3)将剪碎后的绒毛浸泡在35～40℃的温箱中，温箱中包含有胰蛋白酶和DNA酶混合液，消化时间为30～40min；(4)向将消化后得到细胞悬液内添加含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，吹打成细胞悬液；将细胞悬液通过100目铜网过滤后，转移到离心管中，1000～1500r/min，离心3～10min；(5)离心后弃上清，加DMEM/F12培养液重悬细胞，将细胞悬液分别缓慢加入Percoll分离液和淋巴细胞分离液上层，1500～2000r/min，离心25～35min；(6)吸取Percoll分离液两个浓度液面交界处的灰白色云雾状细胞层和淋巴细胞分离液与培养液之间的细胞层，用抗生素盐水和培养液洗涤两次，1000～1500rpm，离心5～10min；(7)向洗涤过后的细胞悬液内添加含20％FBS的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞浓度至1.0×106/ml，分别接种于涂有鼠尾胶原(5‑10U/cm2)和未经胶原处理的6孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2～3h。