[发明专利]一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统

摘要

本发明属于单分子成像技术领域，具体涉及一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统。本发明系统包括：第一物镜、第二物镜、第一平面、第二平面、第一平面镜、凹面镜、第二平面镜、EMCCD；本发明在基本倒置荧光显微镜高速二维探测系统的基础上，通过搭建第二物镜，收集上半球面的荧光信号至第二平面，再由第二平面上的凹面镜返还至样品平面；经过第二物镜放大后，使单分子信号离凹面镜的中心轴的距离与凹面镜焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度。

主权项

1. 一种亚毫秒级实时三维超分辨显微成像系统，其特征在于，包括：第一物镜M1（1）、样品平面（2）、支架（3）、光学平板（4）、第二物镜M2（5）、第一平面镜（6）、凹面镜M3（7）、第二平面镜（8）、EMCCD（11）；其中，光学平板（4）也称为第二平面，第二平面上放置第一平面镜（6）、凹面镜M3（7）、第二平面镜（8）、三角镜架（9）、L型镜架（10）；第一物镜M1（1）和第二物镜M2（5）相对放置，组成倒置荧光显微镜；其中间为显微镜的载物台样品平面（2），称之为第一平面；记S1为原始荧光信号，S2为S1经过第二物镜M2（5）后的像点，S3为像点S2经过凹面镜（7）后的成像点，S4为S3再次经过第二平面镜（8）和第二物镜M2（5）后的成像点；第一物镜M1（1）用于收集标准单分子荧光信号S1的下半球面荧光并成像；光学平板（4）放置于支架（3）上；所述第二物镜M2（5）用于收集荧光信号S1的上半球面荧光并成像；第一平面镜（6）按第二平面水平正方向45度角度架设，并由三角镜架（9）固定，第一平面镜（6）将第二物镜M2（5）收集的荧光反射并在点S2处聚焦成像；所述凹面镜M3（7）放置于第一平面镜（6）的反射光路上，并由一L型镜架（10）固定；像点S2由凹面镜M3（7）的成像原理形成放大的像S3；所述第二平面镜（8）放置于凹面镜M3（7）的反射光路中，通过调节第二平面镜（8）合适的角度进行修正，使得第二平面镜（8）反射的像S3返还至第二物镜M2（5）；第二物镜M2（5）将像S3缩小至样品平面（2）形成像点S4，同时显示在二维EMCCD（11）阵列探测器的焦平面上，在同一EMCCD（11）上同时获得S1和S4两个单分子荧光点；经过第二物镜M2（5）放大后，使得单分子信号离凹面镜M3（7）的中心轴的距离与凹面镜M3（7）焦距的量级相近，达到垂直方向的最佳测量精度；当单分子运动时，通过对运动前后的、由凹面镜M3（7）返还的两个荧光点以及第一物镜M1收集的下半球面原荧光信号点S1的平面相对位置的分析，能够精确快速获取分子在垂直方向的位置信息，原荧光点S1的（x ，y）位置信息可通过二维高斯拟合获得。