[发明专利]一种利用多种生物酶直接制备孕酮的方法

摘要

本发明涉及化学药物的制备方法领域，具体公开了一种将包括胆固醇氧化酶CYP11a1，皮质铁氧还蛋白酶FDX，皮质铁氧还蛋白还原酶FDXR和胆固醇氧化酶CHO)四种生物酶共表达至E.coli上并在转化甾醇类物质制备孕酮的方法。该方法具体步骤如下：1)选取引物CYP，FDX，FDXR和CHO共表达同一宿主；2)引物合成，3)质粒构建，4)诱导表达；5)生物酶转化。本发明利用多种生物酶直接制备孕酮的方法，同时使用这四种酶进行生物转化甾醇类物质制备孕酮，具有一步结构改造，专一性强，环境污染小，而且成本低的等优点。

主权项

1.一种利用多种生物酶直接制备孕酮的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：1)四种酶共表达选取并合成CYP，FDX，FDXR和CHO引物，将包括CYP，FDX，FDXR，CHO在E.coli上共表达，质粒构建顺序为CHO‑FDXR‑FDX‑CYP；2)引物合成CHO引物：RXC‑CHO‑F‑BamHI：CGGGATCCGTGCCCGCAGGTAGCGCAGGTAGRXC‑CHO‑R‑XhoI：CCGCTCGAGTTACGGCAGCAGTTTGTCCATGFDXR引物：RXC‑FDXR‑F‑Xhol：CCGCTCGAGTTAAATCATGAGCACCCAGGAAACCCAGTTTGTCCATGGCAGCAARXC‑FDXR‑R‑SpeI：GACTAGTTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGATGATGACCCAGTAAACGCAGCAFDX引物：RXC‑FDX‑F‑SpeI：GACTAGTGTTTCTTCAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCAGCTCAGAAGATAAARXC‑FDX‑R‑KpnI：GGGGTACCTTAATGATGGTGGTGATGATGGGAGGTCTTGCCCACACYP引物：RXC‑cyp‑F‑Kpnl：GGGGTACCGTTTCTTCAAAGAGGAGAAATACTAGATGATCTCCACCCGCAGTCCTCGCRXC‑cyp‑R‑HindIII：CCCAAGCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTC；3)质粒构建分别以步骤2)所述CHO，FDXR、FDX、CYP合成引物为引物，以相应的CHO、FDXR、FDX、CYP基因序列为模板，扩增CHO、FDXR、FDX、CYP基因，而后分别用各引物上标注的酶切位点酶切各基因，pTrc99A用NcoI/KpnI酶切，然后将CHO、FDXR、FDX、CYP与pTrc99A连接，通过转化感受态E.coli DH5α实现扩大培养，获得单菌落，通过对单菌落进行PCR、质粒提取试剂盒提质粒，并测序鉴定阳性克隆，将获得的阳性克隆命名99A‑O‑R‑X‑P；4)诱导表达阳性克隆99A‑O‑R‑X‑P转化感受态E.coli Transetta DE3，将单菌落接种含LB培养基的试管中并加入抗生素，培养至OD600＝0.55‑0.60，加入终浓度0.5mM的IPTG，诱导过夜；5)生物酶转化在步骤4)所述诱导过夜后，加入甾醇类物质0.1‑0.15g/L菌培养液，转化72h，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩干后，用10ml乙酸乙酯溶解，加入1‑5g硅胶混匀后，再次减压浓缩至干，进行硅胶柱层析，收集含目标组分的流出液，核磁分析检测，最终确认化合物结构，得到所述的孕酮产物。