[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法

摘要

本发明公开了一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：粗提物的制备：巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；常压硅胶柱层析，再次常压硅胶柱层析，第三次常压硅胶柱层析，凝胶柱层析，重结晶。本发明底物廉价易得，工艺简单易行，生产过程环保。

主权项

1.一种利用巨大芽孢杆菌分离提取β－谷甾醇的方法，包括以下步骤：（1）粗提物的制备巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与乙醇，在压力为0.04‑0.06MPa、温度为40‑60℃下回流提取3次，时间为每次4h，得巨大芽孢杆菌提取液，减压浓缩至总体积的1/10‑1/5后加等体积的水溶解，水溶液与等体积的乙酸乙酯萃取得上层乙酸乙酯萃取液，再经减压浓缩至乙酸乙酯挥干，得粗提物；（2）常压硅胶柱层析将粗提物用等体积乙酸乙酯溶解后，与40‑80目硅胶按体积比为1:1.2拌样，70℃水浴挥干乙酸乙酯后上样，在已制备好的硅胶层析柱上进行常压硅胶柱层析；用100%石油醚，体积比为100%石油醚:乙酸乙酯=100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇=30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，100%甲醇进行梯度洗脱，流速为10‑20 mL/min，分段收集洗脱液,通过薄层层析色谱（TLC）分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断，合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩液；（3）再次常压硅胶柱层析浓缩液进行抑菌活性测定，其中对青枯雷尔氏菌活性抑菌率为75%‑85%的浓缩液再次进行常压硅胶柱层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=30:1、10:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得浓缩组分；（4）第三次常压硅胶柱层析浓缩组分又再次进行硅胶层析，用100%石油醚，体积比为100%石油醚：乙酸乙酯=5:1、2:1，100%甲醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，减压浓缩至有机溶剂挥干，得目标粗品；（5）凝胶柱层析将目标粗品先用体积比为1:1的氯仿与甲醇溶液溶解，然后进行葡聚糖凝胶柱层析，用体积比为氯仿：纯甲醇=1:1的氯甲溶液反复洗脱，收集洗脱液，经TLC色谱和显色分析后合并相同组分的洗脱液，其中洗脱组分中有肉眼可见的白色晶体析出；（6）重结晶对洗脱组分析出得到的白色晶体，采用重结晶的方法纯化，得到β‑谷甾醇。