[发明专利]一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明涉及兽医微生物学技术领域，具体涉及一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法。该快疫单价灭活疫苗的制备方法包括：菌株的筛选、菌株的培养、菌株毒力验证及疫苗制备。本发明的腐败梭菌为分离自青藏高原牧区的高产毒鹿源腐败梭菌(QH‑FB01菌株)，常规培养对小白鼠的致死能力可达200MLD/ml，通过优化菌株最佳产毒条件、改进培养基配方，可使该腐败梭菌菌株(QH‑FB01菌株)对小白鼠的致死能力平均达1000MLD/ml，远高于常规疫苗生产用菌株的毒力100MLD/mL，且通过培养条件优化，使该腐败梭菌菌株的培养特性较为稳定，大大降低了生产成本，提高了生产效率。

主权项

1.一种羊快疫单价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1菌株的筛选：S1：菌株厌气培养，将分离保存的菌株分别接种到肉肝胃酶消化汤培养基中，37℃培养12h，抹片镜检呈单一的梭状杆菌，革兰氏染色阳性；24h后，可见呈柠檬状芽孢产生，动物回归试验，在死亡小白鼠肝被膜触片可看见长丝状菌体；S2：DNA检测，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取S1步骤菌株的DNA，利用设计的16SrRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测可在1450bp处检测到目的条带，将扩增产物测序分析，与GENBANK中公布的腐败梭菌的同源性在99％以上，证明菌株血清型符合腐败梭菌属的特性；步骤2菌株的培养：将步骤1检测后的菌株接种到基础培养基中，37℃厌气培养，培养时间为12～72h，pH为7.5～8.8，收集培养液备用；步骤3菌株毒力验证：将步骤2的培养菌物做递倍稀释，稀释比例为1:10，1:100，1:200，1:400，1:600，1:800及1:1000，皮下注射16～20g小白鼠，观察小白鼠死亡情况；步骤4疫苗制备：S1：杀菌、脱毒，将步骤2的收集的培养液按总体积的0.8％加入甲醛溶液，充分摇匀后，排出气体，38℃下杀菌3～5d，脱毒14～21d后，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察5～7d，无菌生长为合格，将脱毒后的培养物0.5ml原液皮下注射16～20g小白鼠5只，无小白鼠死亡为合格；S2：赋性剂的配制，按赋性剂配制方法配制铝胶，使培养物与铝胶的比例为5:1为宜，使每毫升菌苗中含铝胶7mg为准，充分混用后，分装待用；S3：菌苗的安检、无菌检验，随机抽取分装好的菌苗，吸取培养物0.5～1.0ml接种至肉肝胃酶消化汤、普通斜面及营养肉汤中，37℃观察3～7d，无菌生长为合格，将菌苗摇匀后皮下注射16～20g小白鼠1.0ml，小白鼠全部健活为合格。