[发明专利]一种酶法降解2;6-二羟基苯甲酸的方法

摘要

本发明公开了一种酶法降解2,6‑二羟基苯甲酸的方法，包括以下步骤：步骤一：Sdc蛋白表达：步骤二：Sdc的纯化：步骤三：Sdc浓度测定：步骤四：Sdc活力测定。本发明采用已成功构建的带有His标签的Sdc大肠杆菌表达菌株，采用此表达菌株，对Sdc进行诱导表达，收集菌体，经超声破碎、离心后，获得了突变酶的粗酶液，使用His‑TRap亲和层析柱对带有His6标签的Sdc进行纯化，使用纯化后的Sdc分别在不同的温度和pH条件下与2,6‑二羟基苯甲酸进行反应，采用HPLC检测对产物或反应物进行检测，计算相应酶活，确定反应的最适条件，为Sdc的开发利用提供一定的理论支持。

主权项

1.一种酶法降解2,6‑二羟基苯甲酸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL‑1的LB液体培养基中，摇床培养为一号种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL‑1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴中进行超声破碎，将破碎后的细胞破碎液进行离心分离，上清液即为粗酶液；将粗酶液用10～14％的SDS‑PAGE检测蛋白表达情况，采用His‑Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化；步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶Sdc的浓度；步骤四：Sdc活力测定：在浓度为10～60mM的2,6‑二羟基苯甲酸溶液中加入含0.1mg/mLSdc的缓冲溶液，总反应体积为1～2mL，温度25～60℃，加入强酸性溶液终止反应，反应液经9500～10500r/min离心后，经0.22μm滤膜过滤后，用HPLC测定产物浓度。