[发明专利]MSI微卫星不稳定检测的标准品及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种MSI微卫星不稳定检测的标准品及其制备方法和应用，包括样品提取，Q‑PCR，然后毛细管电泳，分析数据等步骤。本发明的MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法，兼顾多种MSI检测标准，兼顾多种重复类型，使用范围广，符合设计原则；采用ATCC的配对细胞作为标准分析样品，性能稳定，可重复再生；采用MSI‑PCR方法检测，多次重复，数据完整、准确、可靠；分发多个单位试用，兼容不同的检测方法和分析方法，完善对应标准品的性能；可以有效的评估临床检测方法学，指导病人入组和用药，具有很好的商业前景。

主权项

1.一种MSI微卫星不稳定检测的标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S101：首先选取10～20对配对细胞，其中，二分之一为肿瘤细胞，其余为正常细胞；然后检测位点BAT‑25、BAT‑26、NR‑21、NR‑24和MONO‑27来评估MSI状况，同时引入Penta C、Penta D、Amel位点；S102：收集细胞；S103：采用promega的DNA提取试剂盒，按照说明书提取DNA；S104：对提取的DNA做QC检测，Qubit3.0检测浓度，Nanodrop检测OD260/280纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，S105：合成引物；S106：配置PCR反应体系20ul，设计PCR程序：37℃，2分钟；94℃，10分钟；94℃，30秒，60℃，1分钟，70℃，1分钟且进行35个循环；60℃，45分钟；4℃，∞；S107：PCR产物毛细管电泳，以seqstudio基因分析仪进行毛细管电泳检测，根据基因分析仪操作说明进行选择“Fragment Analysis”检测，导出数据用GeneMapper软件分析；S108：检测峰高没有出现超阈值现象，否则应稀释PCR产物进行毛细管电泳检测；S109：以正常组织峰图作对照，比较肿瘤组织6个单核苷酸标志物BAT‑26、NR‑21、BAT‑25、MONO‑27、NR‑27和NR‑24和3个双核苷酸重复位点D2S123、D17S250、D5S346片段大小改变情况，产物片段变化超过2.5nt即判定该基因不稳定，反之稳定；再根据同一组织肿瘤样本和对照样本不稳定单核苷酸重复位点的个数，确定该样本微卫星状态；S110：按照步骤S101‑S109重复3次，判断12个位点是否数据统一和稳定，其中，数据稳定、准确的选为标准品。