[发明专利]基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于高分辨熔解曲线形状的多重PCR检测方法及试剂盒。本发明采用PCR饱和荧光染料，扩增完成后直接进行高分辨熔解，对采集的熔解曲线进行归一化、差异化或主成分分析，即可实现单管有效同时检测多个靶序列的目的。根据高分辨熔解曲线形状信息而非熔解温度来进行鉴别检测，显著降低了多重PCR分析引物的设计难度，使得具有微小Tm差异的多个PCR扩增产物能够同时检测；避免了开管操作造成目的DNA被污染的可能性，弥补了多色荧光标记或者空间分隔平行下的单重扩增反应成本较高的缺陷，提高了检测通量，降低了检测成本，具有较强的实际应用价值。

主权项

1.一种用于鉴别不同靶序列的多重荧光PCR方法，其特征在于：该多重荧光PCR方法包括以下步骤：1)根据不同待检样品中的DNA组成情况，确定需要鉴别的不同目的DNA序列；2)设计并合成用于扩增对应目的DNA序列中任意一部分具有特异性的序列片段的引物；3)利用单重PCR扩增验证步骤2)中所设计的引物的有效性以及特异性；4)分别分析目的DNA序列及其任意数量的组合方式，以对应目的DNA序列或包含目的DNA序列的基因组DNA为模板，分别利用经过步骤3)验证的针对不同目的DNA序列的引物进行多重PCR扩增，并在扩增完成后对扩增产物进行高分辨熔解，采用归一化、差异化或者主成分分析对获得的高分辨熔解曲线进行特征提取，然后将提取得到的特征信息合并，得到标准鉴别图谱；5)提取某待检样品中的DNA作为模板，按照步骤4)进行多重PCR扩增以及对扩增产物进行高分辨熔解并获得高分辨熔解曲线，对该高分辨熔解曲线采用与获得所述标准鉴别图谱同样的特征提取方法进行分析，将分析结果与所述标准鉴别图谱比对，根据在所述标准鉴别图谱中经比对所匹配的特征信息确定所述某待检样品中的DNA组成情况。