[发明专利]一种延迟家蚕化蛹的方法

摘要

本发明公开了一种延迟家蚕化蛹的方法。本发明利用在桑叶中添加家蚕核型多角体病毒BmNPV编码表达的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP‑glucosyltransferase，EGT)，使家蚕体内蜕皮激素失去活性，从而延迟家蚕化蛹。其原理是EGT酶可催化将UDP‑葡萄糖中的糖基转移至蜕皮激素的反应而使后者失活，从而阻断家蚕的蜕皮和化蛹。本发明解决了鲜茧必须立即烘干杀死蚕茧内蚕蛹的问题，节省了生产成本，并且能够提供蚕丝的品质，这为实现鲜茧缫丝和提高生产效率创造了条件。

主权项

1.一种延迟家蚕化蛹的方法，其特征在于：(1)家蚕BmNPV编码的蜕皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因的克隆：以家蚕核型多角体病毒BmNPV的基因组为模板，利用PCR方式克隆获得蓖麻EGT基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，获得pCR2.1‑EGT；(2)含有EGT基因的重组杆状病毒的构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1‑EGT得到蓖麻EGT基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA‑EGT；通过共转染在家蚕培养细胞BmN内与BmNPV DNA同源重组产生重组病毒；在离心管中加入1μg的pBlueBacHisA‑EGT DNA和15μg的BmNPV DNA，混匀，并加入14μl脂质体lipofectin，最后加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，获得混合物；将该混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞，再用无血清的TC‑100培养基培养24小时后，换成含有质量浓度为10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清液作为病毒储存原液，用来筛选重组病毒；重组病毒用病毒储存原液通过几轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组病毒溶液，浓度为10⁸pfu/ml；(3)家蚕培养细胞内表达重组EGT蛋白：使用家蚕培养细胞BmN，在培养基中加入上述浓度为10⁶pfu/ml的重组病毒溶液，使病毒感染细胞，然后在27℃下培养，培养96小时后收集细胞和上清液；将收集的细胞和上清液作为重组EGT蛋白纯化的起始材料，使用冻融法和超声波溶解细胞，经高速离心后再收集上清液；用Ni‑NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化，获得重组EGT蛋白；(4)家蚕经口添食EGT蛋白：在家蚕五龄第一天，将10mg/ml的上述重组EGT蛋白喷于桑叶表面，通过添食的方法，让家蚕食下重组EGT蛋白，由此实现延迟家蚕化蛹。