[发明专利]一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法

摘要

本发明公开了一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，通过S1基于麦管制作的胚胎玻璃化冷冻Tip载体的制备、S2冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存、S3冷冻Tip载体的猪囊胚的解冻等步骤，从而实现猪囊胚的高效冻存和解冻。本发明一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，技术简单，操作便捷，不需要操作人员多大的熟练度，成本低、效率高，显著降低胚胎玻璃化冷冻与解冻过程中的胚胎损伤和丢失的发生率，可以很好地应用于人类生殖医学和畜牧业的推广发展。

主权项

1.一种基于麦管冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存和解冻方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：基于麦管制作的胚胎玻璃化冷冻Tip载体的制备A1、将可控恒温热台、金属模块、紫外灯、麦管、眼科手术剪、订书机、订书针、格尺擦拭干净，并且用75％酒精对可控恒温热台、金属模块、眼科手术剪、订书机、订书针、格尺消毒后自然晾干；A2、将可控恒温热台温度调节至50～60℃，待温度稳定后，操作人员带上防烫伤手套；A3、使用格尺，在距离麦管开口端长1cm和2cm位置，以及在麦管开口处测量0.15cm宽度，分别进行简单标记；A4、根据上一步标记，使用眼科手术剪剪开麦管，在麦管开口端剪留宽0.15cm、长1cm的塑料条；在可控恒温热台上，使用金属模块将除塑料条的其他部分麦管压平，并在上一步2cm标记位置使用订书机和订书针进行装订；A5、将上一步制作好的麦管，在紫外灯下灭菌12～18min，并随机抽取两支灭菌后的麦管检验微滴立体性能，检验合格后，即完成了胚胎玻璃化冷冻Tip载体的制备；S2：冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存B1、将PN期猪孤雌胚胎显微操作去脂，并在PZM3中培养7天；B2、将培养的去脂猪囊胚在HM液滴中清洗2次，在室温下、ES液体中平衡5～10min进行处理；B3、将上一步处理后的猪囊胚，以5枚为一组移入VS液滴中，立即使用移胚针将VS液滴中的5枚胚胎均匀点在S1步骤制得的胚胎玻璃化冷冻Tip载体的宽0.15cm、长1cm的塑料条上，并将装载有猪囊胚的冷冻Tip载体投入液氮中，整个过程的时间不超过60s，即完成整个冷冻Tip载体的猪囊胚的冻存；S3：冷冻Tip载体的猪囊胚的解冻C1、将装载有猪囊胚的冷冻Tip载体从液氮中取出，快速插入到加热的TS解冻液中，保持静止15～25s后，猪囊胚与冷冻Tip载体解冻分离；C2、将上一步解冻分离的猪囊胚，在1min内移入DS稀释液中平衡5min，然后移入WS1液中平衡3min，最后移入WS2液中平衡3min；C3、将上一步经WS2液平衡处理的猪囊胚，移入PZM3中培养皿培养8h，然后观察猪囊胚的囊胚腔的复扩张状况，即完成了冷冻Tip载体的猪囊胚的解冻的整个过程。