[发明专利]一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法

摘要

本发明公开了一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法。阳极氧化铝纳米通道两端处喷涂金层，金层一部分作为电极，金层另一部分作为导电部分，导电部分包裹绝缘物，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，制成集成式纳米通道电极；金层作为电极反映电化学性能，并且纳米通道本身作为纳米级过滤器，构建集分离和检测于一身的系统；磁性纳米粒子与抗体的复合物捕获样品中的细菌后，保留在集成式纳米通道电极的表面上。本发明提供了一种快速简便的基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，为纳米通道的研究带来了新的思路，并为分离和检测领域提供了新的途径，进一步保障食品和环境安全。

主权项

1.一种基于集成式纳米通道电极分离检测沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)集成式纳米通道电极的制备和预处理(1.1)制备集成式纳米通道电极阳极氧化铝(AAO)纳米通道两端处喷涂金层，金层的一部分暴露作为电极，金层的另一部分作为导电部分，导电部分用绝缘物密封包裹并绝缘，两端金层的导电部分均用导线引出连接到外部的电源，从而形成集成式纳米通道电极(INCE)；(1.2)集成式纳米通道电极的清洗和预处理在集成式纳米通道电极(INCE)两端的金层处分别滴加10μL 0.5M H₂SO₄溶液，静置清洗15分钟，然后用H₂O彻底冲洗；然后在冲洗干净的集成式纳米通道电极(INCE)的两端处分别再滴加10μL 1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液，常温下封闭1小时，然后用H₂O彻底冲洗；(2)磁性纳米粒子‑抗体复合物制备将羧基磁性纳米粒子用含吐温‑20的2‑(N‑吗啉)乙磺酸磷酸盐缓冲液(MEST)清洗并离心3次，重悬在10mM N‑羟基琥珀酰亚胺磺酸(NHSS)和15mM 1‑乙基‑(3‑二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐(EDC)的溶液中，含吐温‑20的硼酸盐缓冲液(BST)清洗并离心3次，重悬在17μg/mL沙门氏菌抗体的含吐温‑20的硼酸盐缓冲液(BST)溶液中反应2.5小时，加入10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭1小时，用含吐温‑20的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗三次并重悬，制备获得磁性纳米粒子‑抗体复合物(MNPs‑Ab)于4℃保存备用；(3)细菌培养和平板计数(3.1)培养沙门氏菌取0.5mL沙门氏菌储备液于9mL脑心浸液培养基(BHI)中，放于37℃的摇床内培养过夜作为初始菌液，将初始菌液在沸水中灭活10分钟以彻底灭菌，PBS清洗三次并重新分散于PBS中，用无菌PBS溶液10倍稀释得到一系列稀释液，获得菌液，以供进一步使用；(3.2)沙门氏菌平板计数取10³CFU/mL含量的步骤(3.1)获得的菌液100μL铺盘于XLT4琼脂培养基中，37℃培养24小时后，对形成的菌落进行计数；(4)电化学方法检测细菌(4.1)将100μL的磁性纳米粒子‑抗体复合物(MNPs‑Ab)与1mL的步骤(3.1)获得的菌液混合，在常温下孵育45分钟；进行磁分离处理，然后用200μL的含吐温‑20的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗三次，最终重新分散于50μL的含吐温‑20的磷酸盐缓冲液(PBST)中，得到细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物(MNPs‑Ab‑St)；(4.2)将集成式纳米通道电极(INCE)夹在3D装置中，取10μL细菌、抗体和磁性纳米粒子的复合物(MNPs‑Ab‑St)注入3D装置中的集成式纳米通道电极(INCE)一侧之后，施加压力使溶液流经集成式纳米通道电极(INCE)至集成式纳米通道电极(INCE)的另一侧；(4.3)用含吐温‑20的磷酸盐缓冲液(PBST)代替复合物MNPs‑Ab‑St溶液以步骤(4.2)同样的操作注入两次后，将10μL的K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆溶液分别注入3D装置中集成式纳米通道电极(INCE)的两侧表面，并进行电化学阻抗(EIS)测试，检测集成式纳米通道电极(INCE)两端电极的信号，经信号处理获得沙门氏菌的检测结果。