[发明专利]一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β-conglutin的方法

摘要

本发明涉及一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取含量最高、强致敏性的致敏羽扇豆球蛋白‑β‑conglutin，以羽扇豆粉为原料，经过丙酮、Tris‑HCl、硫酸铵等试剂处理后，通过离心、阴离子交换层析和凝胶排阻层析，促进分离目标蛋白质，分离提纯获得纯度较高的目标物，采用SDS‑PAGE凝胶电泳对分离的蛋白质进行表征。基于此背景，为后续进一步探究蛋白性质、相应特异性抗体的生产及人类毒性的研究奠定基础。此方法可以选择性的分离目标过敏原并获得高纯度的蛋白质成分，有助于准确地确定羽扇豆浓度。除此之外，通过观察提取出的过敏原与相应血清中免疫球蛋白E的反应，可阐释过敏原的毒性特性并为进一步探测食品中羽扇豆过敏原所进行的分析实验提供关键信息。

主权项

1.一种从澳大利亚甜羽扇豆粉中提取β‑conglutin的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)丙酮脱脂将羽扇豆粉末和丙酮按1∶10(W/V)混合，借助磁力搅拌器在3～6℃冰箱中搅拌脱脂1～3h，之后用冷冻离心机在9000r/min3～6℃条件下离心10～20min，得到沉淀；所得沉淀反复脱脂3～5次，完成后，将沉淀放于通风橱中过夜风干丙酮，干后得脱脂的羽扇豆粉末；(2)盐析法粗提称量脱脂后的羽扇豆粉，按1g羽扇豆粉加入5mL 50mmol/L含1.0mol/L NaCl的Tris‑HCL缓冲液提取蛋白，搅拌均匀后放置在3～6℃冰箱中磁力搅拌过夜，提完后3～6℃条件下在离心机中10000～12000r/min离心15～30min，羽扇豆过敏原粗提液为离心所得的上清液；(3)硫酸铵分级沉淀按每100mL上清液加入76.7g硫酸铵提取，提取3～5h后10000～12000r/min离心15～30min，弃去上清，得到白色沉淀即为粗蛋白；(4)阴离子交换层析法分离纯化将步骤(3)得到粗蛋白溶于PBS溶液装于透析袋中，封好后，放置在3～6℃冰箱中借助磁力搅拌装置在1×PBS溶液中透析2～3天，每隔3～4h换液一次；完成透析后将所得溶液取出放于30kDa超滤离心管中以7000～9000r/min超滤离心15～30min；选取DEAE–Sepharose为填料，取出100g后利用循环水真空泵进行抽滤，完成后将所得固体溶于蒸馏水中再进行抽滤，重复水洗抽干三次以保证除去乙醇；用蒸馏水冲洗柱子末端以排除死腔中的气体，关闭柱子出口，并使柱子里含有2‑3厘米高度的蒸馏水；将匀浆连续倒入层析柱中并一边沉降一边用洗耳球轻轻敲打，使填料装填紧实；待胶床稳定后，打开层析柱底端出口，使液体流出，用蒸馏水冲洗5～7次，用Tris–HCl缓冲液冲洗两次，最后用Tris–HCl缓冲液封柱；将所得蛋白浸提液解冻过滤后，上样至已用Tris–HCl缓冲液平衡完全的DEAE–Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱中，配制含有NaCl的Tris–HCl缓冲液并用其进行梯度洗脱，缓冲液使用前超声处理15～30min，流速为1.5mL/min，待蛋白浓度在20～30min稳定后再更换不同浓度洗脱液，收集各个洗脱峰，得到粗β‑conglutin；(5)凝胶排阻层析法将上步所得含有过敏原β‑conglutin的洗脱峰溶液浓缩，上样至已用Tris‑HCl缓冲液平衡完全的Superdex 200pg凝胶排阻层析柱中，上样完毕后，再用Tris‑HCl缓冲液洗脱，流速为0.2mL/min，收集各个洗脱峰溶液，得到更纯的β‑conglutin。