[发明专利]一种利用毕赤酵母菌制备抗菌肽T9W的方法在审
| 申请号： | 201910598800.0 | 申请日： | 2019-07-04 |
| 公开（公告）号： | CN110438139A | 公开（公告）日： | 2019-11-12 |
| 发明（设计）人： | 单安山;马秋元 | 申请（专利权）人： | 东北农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/81;C07K7/08 |
| 代理公司： | 哈尔滨市哈科专利事务所有限责任公司 23101 | 代理人： | 吴振刚 |
| 地址： | 150030 黑龙江省哈尔滨市香*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | 本发明的目的在于提供一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法。编码抗菌肽T9W的DNA序列，如SEQ ID No.1所示，并将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA‑T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10。用电转化方法将质粒转入到毕赤酵母菌X‑33感受态细胞中，阳性转化子在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。为进一步扩大发酵提供理论依据。本专利选用毕赤酵母作为抗菌肽T9W的表达宿主，完成了T9W的体外表达，本发明有效降低了抗菌肽T9W的生产成本，表达量高达13mg/L，实现了抗菌肽T9W的高效表达，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题。 | ||
| 搜索关键词： | 抗菌肽 毕赤酵母菌 毕赤酵母 验证 基因序列克隆 重组表达载体 编码抗菌肽 感受态细胞 阳性转化子 表达宿主 表达载体 分泌表达 高效表达 化学合成 体外表达 表达量 双酶切 诱导剂 测序 构建 质粒 制备 生产成本 发酵 转入 保存 转化 | ||
【主权项】：
1.一种利用毕赤酵母菌表达抗菌肽T9W的方法，其特征在于，方法如下：根据毕赤酵母的密码子偏爱性对抗菌肽T9W的氨基酸序列进行人工设计编码，编码抗菌肽T9W的DNA序列如SEQ ID No.1所示，并在其5’端连接限制性核酸内切酶XbaI酶切位点和Kex2信号肽切割位点，3’端连接两个终止密码子TAA，在基因片段终端连接限制性核酸内切酶XhoI酶切位点，将该基因序列克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，构建重组表达载体pPICZαA‑T9W经双酶切及测序验证，验证正确后保存于E.coli Top 10，利用电转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌毕赤酵母菌X‑33中，在诱导剂的作用下，实现抗菌肽的分泌表达。
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