[发明专利]用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法

摘要

本发明公开了一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，先对受到污染的豆瓣样品进行菌株分离，然后提取DNA，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将细菌16SrRNA转化到大肠杆菌感受态细胞培养，采用菌落PCR法获得阳性克隆子，提取质粒，测序，在GenBank数据库做相似性分析，确定菌株的分类学地位，确定毒力致病因子基因，设计引物，先优化单重LAMP反应体系，再优化反应温度，引物浓度和Mg²⁺浓度，获得二重LAMP反应体系，检测二重LAMP反应体系的特异性和灵敏性，然后将其运用到受污染豆瓣的菌株筛查中。本发明用二重LAMP进行快速、准确鉴定分离的调味品致病菌，可以对调味品中的致病菌进行控制和预防。

主权项

1.一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于包括如下步骤：(1)菌株分离将豆瓣样品梯度稀释后涂布在平板培养基上，培养获得单个菌落，挑取菌落并利用生理盐水制成菌液；(2)基因组DNA提取及未知菌鉴定①细菌DNA的提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，在1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取菌株的DNA；②未知菌株的PCR扩增上引物：Eu27F，10μmol·L^‑1；下引物：1490R，10μmol·L^‑1；以提取到的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：dd water 16μL、冰上解冻的10×Taq缓冲液2μL、冰上解冻的d NTP 2μL、25mmol·L^‑1的MgCl₂ 1.5μL、上下引物和模板各1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR条件：95℃预热5min，95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min；③重组质粒构建及16SrRNA鉴定对细菌16SrRNA基因与p GEM‑T easy进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养，采用菌落PCR方法挑选阳性克隆子，选择鉴定为阳性的克隆子扩培，提取质粒，酶切、测序鉴定；测序结果通过16SrRNA序列校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度为99％的菌株，确定菌株的分类学地位，进行编号；(3)二重LAMP鉴定致病菌①LAMP引物设计根据菌株的分类学地位，确定菌株的毒力致病因子基因，对毒力致病因子基因进行引物设计，每个毒力致病因子基因设计两对不同特异性的引物；②单重LAMP反应体系的优化选择一个编号的菌株，进行单重LAMP实验，对反应体系进行优化，确定25μL反应体系中的成分；对影响扩增效率的Mg²⁺浓度、温度及引物浓度进行优化：在60℃条件下，Mg²⁺添加量分别设定为：1.3、1.5、1.6、1.7μL；在Mg²⁺添加量为1.5μL时，扩增温度分别设定为：58、60、62、64℃；在上述两个单因素结果基础上，引物浓度分别设定为：1.8、2.0、2.2、2.4μL；对比扩增结果，选择条带清晰、重现性好的反应温度、引物浓度和Mg²⁺浓度作为25μL反应体系的二重LAMP反应温度，引物浓度和Mg²⁺浓度；③二重LAMP特异检测致病菌把两对不同特异性的引物加入到优化后的同一25μL反应体系中，以步骤(2)筛选的菌株的基因组DNA及非目标菌株的基因组DNA为模板，分别进行LAMP检测，应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，验证该方法检测步骤(2)编号的菌株的准确性及特异性；④验证二重LAMP的灵敏性将步骤(2)筛选的菌株的DNA模板进行10倍梯度稀释至最低达到1fg/μL，进行LAMP扩增，电泳检测结果验证该方法检测步骤(2)编号的菌株的灵敏性；(4)筛查方法的运用当验证二重LAMP的准确性及特异性时，扩增结果仅步骤(2)编号的菌株显示阳性，非目标菌株显示阴性，表明准确性高；两对不同特异性的引物在各DNA模板共存在的环境中能特异性扩增表明特异性强；验证二重LAMP的灵敏性时确定检测菌株的最高稀释倍数；将其他豆瓣样品稀释后直接采用步骤(3)确定的方法筛查是否含有步骤(2)编号的菌株。