[发明专利]一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法

摘要

本发明涉及一种人源脐带间充质干细胞的培养和冻存方法，所述培养方法包括先从脐带组织中分离培养原代种子细胞，然后将原代种子细胞进行扩大培养的步骤，本发明通过在原代种子细胞培养阶段，创造性的采用第二次原代贴壁培养的方法，大幅缩短了原代种子细胞分离培养时间，提高了原代种子细胞数量，提高了原代种子细胞纯度，为临床研究和应用提供了充足的标准化种子细胞和培养方法。本发明制备得到的人源脐带间充质干细胞，在体、内外均可以向成骨、成软骨、成脂分化。本发明所述冻存方法通过采用无血清冻存液冻存体系，保证了所冻存细胞无动物源成分，且不使细胞受损，复苏后细胞活性好。

主权项

1.一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从脐带组织中取华通氏胶部分组织，剪切得到组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO₂的培养箱中倒置培养2～4h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO₂的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第10～12天，先加入TrypLE^TMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第一次原代种子细胞；(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第6～8天，先加入TrypLE^TMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第二次原代种子细胞；(3)将第一次原代种子细胞与第二次原代种子细胞合并，得到总的原代种子细胞；将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至80～90％融合时，先加入TrypLE^TMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经数次所述传代培养，得到纯化的人源脐带间充质干细胞；所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+2～10ng/mlVEGF+2～10ng/ml BFGF+2mmol/L L‑Gln。