[发明专利]一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，设计chIRF3的引物扩增其cDNA，双酶切处理扩增产物和PET‑32a质粒再连接构建重组载体，导入感受态DH5α细胞，筛选阳性克隆重组体并转入BL21细胞，涂布含Amp的LB固体培养基中37℃倒置过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB培养基中过夜培养，加入IPTG诱导表达，并优化诱导条件，纯化chIRF3蛋白后免疫大白兔，制备多克隆抗体，多克隆抗体经过Western‑Blot检测鉴定。结果扩增得到chIRF3片段长度为1488bp，重组质粒chIRF3‑PET长度为7388bp，重组质粒双酶切结果的两条带分别是5900bp和1488bp，由此可得chIRF3‑PET重组成功。重组质粒原核表达的蛋白分子量为83kDa，诱导表达最佳诱导时间为4h，IPTG诱导最佳浓度为0.08mmol/L，利用chIRF3蛋白制备的多克隆抗体对chIRF3蛋白具有明显特异性。

主权项

1.一种chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述chIRF3的原核表达及多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：步骤①：引物设计，引物序列如下：chIRF3‑F：5’‑GGGGTACC(Kpn Ⅰ酶切位点)ATGGCAGCACTGGACAGCGAG‑3’；chIRF3‑R：5’‑GGGAAGCTT(KindⅢ酶切位点)TCAGTCTGTCTGCATGTG‑3’；步骤②：cDNA的扩增，将新鲜的鸡肝脏组织研磨成细胞，提取总RNA后使用RNA纯化试剂盒纯化，利用HiFiScript cNDA第一链合成试剂盒逆转录成cDNA；步骤③：以逆转录产物cDNA作为模板，配置25μl的PCR扩增体系扩增；步骤④：使用DNA纯化试剂盒纯化的PCR产物和大肠杆菌PET‑32a分别经过Kpn Ⅰ酶与KindⅢ酶进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收，配置10μl的连接体系；步骤⑤：chIRF3‑PET重组质粒的收集，取10μl的连接产物加入100μl的大肠杆菌DH5α，混合后置于冰上20min，45℃热击90s，迅速放回冰上静置5min，接种于含Amp的固体培养基中倒置培养，挑取单菌落于含Amp的培养基中过夜培养，离心收集菌体提取chIRF3‑PET重组质粒，通过酶切和PCR鉴定质粒证实构建成功；步骤⑥：chIRF3蛋白制备，将3μl的chIRF3‑PET重组质粒加入50μl的感受态表达菌株BL21冰上30min，45℃热击90s，迅速放回冰上5min，含Amp的LB固体培养基中37℃倒置过夜培养，挑取白色单菌落于含Amp的LB培养基中过夜培养，加入IPTG诱导表达，诱导参数的温度、时间和转数的设置；步骤⑦：抗chIRF3蛋白多克隆抗体的制备，利用His标签蛋白纯化试剂盒进行chIRF3的蛋白纯化，纯化后的chIRF3蛋白作为抗原制备chIRF3多克隆抗体，在13周龄雄性新西兰大白兔背部皮下多点进行4次免疫后，颈动脉取血分离血清并纯化得到抗chIRF3蛋白多克隆抗体，冻干后置于‑80℃保存。