[发明专利]一种二倍体毛白杨的遗传转化方法

摘要

本发明涉及一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，首先采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，清洗消毒后依次进行增殖继代培养、芽伸长培养和生根培养，得到毛白杨无菌苗，挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，制备菌液作为侵染液；将毛白杨无菌苗的叶片切成叶盘，培养7d后转入侵染液中进行侵染，侵染后的叶盘先黑暗培养后光照恢复培养，最后进行抗性芽的筛选，得到候选植株，对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将均为阳性的植株进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株。本发明方法具有转化效率高、培育周期短、可大规模投入生产等优点，二倍体毛白杨的遗传转化体系可为规模化培育新品种、定向改造优良性状提供帮助。

主权项

1.一种二倍体毛白杨的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)毛白杨无菌苗的获得：采集雄性二倍体毛白杨幼嫩的含芽茎段作为外植体，流水下冲洗1‑2h后，进行消毒处理，无菌水清洗后，接入1/2MS培养基进行培养，培养30d后得到毛白杨无菌苗新鲜叶片，采集幼嫩叶片放入增殖继代培养基中进行培养，35d后获得大量毛白杨不定芽；剪取不定芽接种于芽伸长培养基，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，45d后顶芽形成完整根系，得到毛白杨无菌苗；增殖继代培养基配方：1/2MS+0.5mg/L 6‑BA+0.5mg/L NAA+0.005mg/L TDZ，pH 5.8；(2)根癌农杆菌侵染转化：挑取携带pBI121载体质粒的根癌农杆菌，制备OD₆₀₀为0.3‑0.5的菌液作为侵染液；选取生长45d‑60d的毛白杨无菌苗，切去第三至第五位叶片的维管束组织，并将叶片切成1cm×1cm叶盘，接种于愈伤分化培养基上，培养7d后，将叶盘转入侵染液中进行震荡侵染，侵染10‑30min后，取出叶盘，用无菌纸吸干叶盘表面多余菌液，将叶盘转入共培养基中，在黑暗条件下培养8‑32h，洗菌后转入恢复培养基中在1800‑2000lux的光照条件下恢复培养7d；恢复培养基配方：1/2MS培养基，pH＝5.8；(3)抗性芽的筛选将恢复培养后的叶盘转入含抗生素的筛选培养基平板上，进行筛选培养，筛选出的叶盘用无菌水漂洗后转入分化筛选培养基进行培养，当叶盘边缘长出1‑1.6cm不定芽时，将其转到芽伸长培养基上进行培养，当不定芽在芽伸长培养基中生长至2cm以上时，将不定芽剪下转入生根培养基上进行培养，培养至长出根系，得到候选植株；(4)对候选植株进行GUS染色和PCR检测，将GUS染色和PCR检测均为阳性的植株，进行炼苗和移栽，得到二倍体毛白杨转基因植株。