[发明专利]基于高通量测序的DNA甲基化检测方法

摘要

本发明公开一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，通过用亚硫酸氢盐处理DNA片段，通过末端转移酶延伸单链DNA片段的3’末端引入核苷酸同聚物序列，通过与核苷酸同聚物序列互补的引物延伸产生双链并引入测序公共接头序列，通过5’端生物素修饰将延伸的序列结合到链霉亲合素包被的磁珠上以及第二次3’末端引入核苷酸同聚物序列，通过第二条带有公共接头序列的引物延伸引入第二公共接头序列，通过用公共PCR引物扩增延伸的DNA产物制备出基因组甲基化特异的DNA测序文库，然后对DNA测序文库进行测序确定DNA片段的序列。本发明具有高通量、高特异性、高灵敏度的优点，能很好地适用于片段化的血液游离DNA和石蜡包埋组织DNA，尤其是短片段DNA的甲基化检测。

主权项

1.一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)用亚硫酸氢盐处理待测基因组DNA，亚硫酸氢盐将DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U)，而甲基化胞嘧啶保持不变，从而使得最初互补的单链DNA不再互补，从而得到单链DNA；2)用T4核酸激酶处理单链DNA使3’端去磷酸化得到3’端去磷酸化DNA；3)用末端转移酶TDT延伸3’端去磷酸化DNA，在3’端引入核苷酸同聚物序列；4)将3’端引入核苷酸同聚物序列的DNA用5’端生物素修饰的、含有第一公共接头序列的以及含有与3’末端引入核苷酸同聚物序列互补序列的引物PrimerU1G进行杂交退火，并用DNA聚合酶进行延伸；5)循环延伸线性增加延伸产物量；6)纯化去除未延伸的单链延伸引物；7)通过5’端生物素修饰将延伸的引物序列结合到链霉亲合素包被的磁珠上，通过DNA变性分离非结合链；8)用末端转移酶TDT延伸结合在链霉亲合素磁珠上的单链DNA片段，在3’末端引入核苷酸同聚物序列；9)用含有第二公共接头序列和含有与3’端引入的核苷酸同聚物序列互补序列的引物Primer U2A与固定在磁珠上的单链DNA互补区域杂交，并加入DNA聚合酶进行延伸；10)用含有第一个测序接头序列和第二个测序接头序列的PCR引物扩增延伸的DNA产物制备出基因组甲基化特异的DNA测序文库；11)对PCR扩增文库进行高通量测序确定DNA片段的序列。